• 快讯 CRISPR/Cas9技术:基因魔剪

    编译服务:转基因生物新品种培育
    编译者:王晶静
    发布时间:2020-12-31
    解析了2020年度诺贝尔化学奖两位获奖者在CRISPR/Cas9基因编辑技术领域所做的卓越贡献,并探讨CRISPR/Cas9基因编辑技术的最新挑战与突破方向.
  • 快讯 OsRPK1基因过表达和RNA干涉对水稻苗期耐盐性的影响

    编译服务:转基因生物新品种培育
    编译者:王晶静
    发布时间:2020-12-31
    水稻OsRPK1基因属于富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶, 在盐胁迫下其表达量暂时升高后出现明显下降. 前期研究表明, OsRPK1基因过表达会造成拟南芥非生物胁迫耐受性明显降低. 本研究对OsRPK1基因在水稻中实现过表达和RNA干涉, 进而对OsRPK1的抗逆性功能加以探究. 结果表明, OsRPK1基因表达量增加时, 水稻幼苗表现为耐盐性下降; RNA干涉则使水稻幼苗表现为耐盐性增加. 盐胁迫后OsRPK1过表达植株脯氨酸含量低于野生型、MDA含量和相对电导率显著高于野生型, 而OsRPK1-RNAi水稻植株的脯氨酸含量显著高于野生型、MDA含量和相对电导率显著低于野生型. 因此, OsRPK1基因的表达量对水稻耐盐性具有明显影响, 脯氨酸含量及细胞质膜受破损程度的改变可能是造成转基因水稻耐盐性变化的内在原因. 本研究为进一步阐明OsRPK1基因的抗逆作用机制奠定了基础, 对于通过调整该基因表达改良水稻的耐盐性具有重要意义.
  • 快讯 亚洲棉短绒突变体纤维发育及其差异基因表达分析

    编译服务:转基因生物新品种培育
    编译者:王晶静
    发布时间:2020-12-31
    棉花纤维是重要的天然纺织材料, 是最长的单细胞, 是研究纤维发育的良好材料. 本研究以亚洲棉短绒突变体(FZ)及其野生型(fz)为材料, 结合扫描电镜、石蜡切片、RNA-seq技术, 解析棉花短绒起始的可能机制. 与野生型(fz)的0DPA时期胚珠相比, 突变体的胚珠在该时期仅有少量的纤维起始. 在+3DPA时, 突变体没有短绒细胞起始, 仅有长纤维细胞, 而野生型有大量的短纤维细胞和长纤维细胞. 对这2个材料的0DPA、+3DPA、+5DPA和+8DPA胚珠差异基因分析结果显示, 在短绒突变体(FZ)和野生型(fz)的4个纤维发育时期共挖掘出3780个差异表达基因, 其中0DPA时差异基因数目最少, 随着胚珠发育时间的延长, 差异基因的数目逐渐增加. KEGG分析发现这些基因主要参与蜡质、角质生物合成, 以及苯丙烷代谢和植物信号传导过程. 共表达趋势分析显示, 在突变体+3DPA上调的差异基因中, 参与离子结合、MAPK级联反应、氧化还原活性和转录调控的基因表达受到正影响(表达水平提高), 造成突变体短绒纤维不能正常起始. 这些结果描述了二倍体亚洲棉短绒起始的动态变化, 可为进一步研究棉纤维发育提供参考.
  • 快讯 利用WGCNA鉴定棉花抗黄萎病相关基因共表达网络

    编译服务:转基因生物新品种培育
    编译者:王晶静
    发布时间:2020-12-31
    加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA)作为一种典型的系统生物学方法, 可用来鉴定协同表达的基因模块, 探索模块与目标性状之间的生物学相关性, 并挖掘网络中的核心基因. 黄萎病(Verticillium wilt)可严重降低棉花(Gossypium spp.)的产量及品质, 因此研究抗病基因及抗病机制, 对于棉花抗病育种工作具有重要意义. 本研究以黄萎病菌侵染不同时间点的海岛棉(Gossypium barbadense)幼苗根尖转录组数据为基础, 分析其差异表达基因, 并选取在不同样本之间表达水平变异最大的前50%基因(共35,647个)进行WGCNA. 结果表明, 在黄萎病菌侵染条件下, 共有22,850个基因差异表达, 其中4685个为所有侵染时间点共有的差异基因. 共鉴定到18个基因共表达模块, 其中5个为抗黄萎病相关特异性模块(black、mediumpurple3、darkolivegreen、plum3模块分别与侵染2 h、6 h、48 h、72 h时间点正相关; mediumpurple2与侵染2 h时间点负相关). GO和KEGG富集分析表明, 特异性模块可以富集到有生物学意义的富集结果, 如刺激响应、钙离子结合、黄酮类化合物合成代谢等抗逆相关通路. 通过计算模块内基因的连通性, 挖掘出了网络中的核心基因, 功能预测表明, 这些基因可能在逆境胁迫响应中发挥重要作用. 本研究为进一步理解棉花抗黄萎病的分子机制、选育棉花抗病新品种提供了理论指导.
  • 快讯 基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白体DNA定点内切酶体外活性建立高效基因型分析技术

    编译服务:转基因生物新品种培育
    编译者:王晶静
    发布时间:2020-12-31
    建立快速、准确、高通量与简便易行的基因型分析技术对基因功能解析、分子育种与突变体鉴定研究具有重要价值. 本研究的目标是利用Cas9或Cas9NG变体与单分子指导RNA (single guide RNA, sgRNA)核糖核蛋白复合体(sgRNA/Cas9-RNP或sgRNA/Cas9NG-RNP)体外DNA定点内切酶活性, 建立与优化简便高效与低成本的基因型分析技术. 以我们前期创制的CRISPR/Cas9定点编辑玉米ZmWx基因第7外显子区域定点突变基因编辑后代分离群体为材料, 以ZmWx靶位点两侧特异引物扩增的PCR产物为底物, 利用原核表达并纯化的Cas9或Cas9-NG蛋白为DNA内切酶, 以体外转录的靶向ZmWx基因靶点的sgRNA或骨架序列优化的sgRNA (enhanced sgRNA, esgRNA)为Cas9或Cas9-NG酶定点活性指导元件, 通过体外组装为sgRNA/Cas9-RNP复合体, 对目标样本进行酶切, 以区分目标位点野生型、纯合突变体、杂合突变体基因型, 并对反应体系进行了优化. 研究表明, 基于esgRNA/Cas9的PCR/RNP检测技术可对ZmWx基因编辑目标突变体后代进行快速有效的基因型鉴定; 实验体系优化结果表明, esgRNA/Cas9蛋白质量比为1∶1, 各为1 μg, 20 μL反应体系, 37°C酶切0.5 h, 可对500 ng待测DNA底物充分酶切并确定基因型; esgRNA/Cas9NG反应体系优化结果表明, 当esgRNA与Cas9-NG蛋白均为2 µg时, 37°C酶切4 h, 可对500 ng DNA底物进行酶切并实现基因型分析. 利用Cas9NG拓宽靶位点检测范围的研究结果, 暗示Cas9NG是以牺牲核酸酶酶切活性为代价降低了Cas9蛋白对PAM (protospacer adjacent motif, PAM)基序NGG序列的依赖性, 实现PAM-NG基序识别能力, sgRNA/Cas9NG检测效率等仍有待提升与优化. 本研究为基因功能解析、分子育种与突变体鉴定等研究提供了一套简便、成本低廉的技术方法, Cas9NG体外内切酶活性及其效率也为该Cas9突变体活体基因编辑技术研发提供了参考数据.