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《Nature | 揭示外源核酸诱导的原核生物短Ago蛋白系统发挥功能的分子机理》

  • 来源专题：战略生物资源
  • 编译者： 李康音
  • 发布时间：2023-10-04

  • 2023年10月2日，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心丁玮团队和朱洪涛团队与中国医学科学院和北京协和医学院病原生物研究所崔胜团队合作，在Nature上发表了题为Nucleic Acid-triggered NADase activation of a short prokaryotic Argonaute的研究论文。

    该研究通过高分辨冷冻电镜技术与自主研发的自动化结构解析策略，在数百万计的冷冻电镜蛋白质颗粒中，高效地筛选并重构了与五个与原核短Ago系统相关的高分辨率三维结构——自抑制的功能单元单体、载有引导RNA/靶向DNA的功能单元单体、两个不同构象的功能单元的二聚体和功能单元的四聚体。该研究为剖析原核短Ago系统如何发挥功能奠定了重要的结构基础，并揭示了原核短Ago中NADase的激活机制以及导致细菌死亡的分子机理。



    本文内容转载自“水天聊循证”微信公众号。

    原文链接: https://mp.weixin.qq.com/s/BAWcZ4TA-8HTu4HNiuH-OQ

  • 原文来源：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06665-6
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  • 《Nature丨揭示新型anti-CRISPR蛋白的作用机理》
    • 来源专题：战略生物资源
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2024-07-07
    • 2024年7月3日，加拿大多伦多大学的Alan Davidson研究团队和中国科学院生物物理研究所的王艳丽研究团队合作在Nature上发表题为An anti-CRISPR that pulls apart a CRISPR–Cas complex的研究论文，发现了一种新型anti-CRISPR蛋白——AcrIF25，能够通过解离I-F型CRISPR-Cas复合体（Csy复合体）的方式抑制CRISPR-Cas系统的活性，为CRISPR-Cas系统的精确控制提供了新的思路。 在I-F型CRISPR-Cas系统中，效应复合体称为Csy复合体，由CRISPR RNA (crRNA) 和4种 Cas 蛋白组成。Cas5和Cas8形成异二聚体与crRNA 5'端结合，Cas6与crRNA 3'端的发卡结构结合，六个Cas7亚基沿着crRNA中间排列组成复合体的骨架结构。Csy复合体特异性识别外源核酸，并招募Cas3核酸酶将其降解。目前，已知的大多数I-F型Acr蛋白通过直接与Csy复合体结合，从而抑制CRISPR-Cas系统。 在该研究中，研究人员首先通过生物信息学的方法鉴定出了一种新的anti-CRISPR蛋白，命名为AcrIF25。噬菌斑实验显示，AcrIF25能够显著抑制铜绿假单胞菌I-F型CRISPR-Cas系统的活性。为了确认AcrIF25是否能够直接结合Csy复合体，研究人员将纯化的AcrIF25 与Csy复合体混合并进分子排阻凝胶层析。令人惊讶的是，AcrIF25没有与完整的Csy复合体结合，而是与其中的Cas7亚基结合，并将Cas7从完整的Csy复合体中分离出来，留下Csy复合体的其余组分（Cas5、Cas6、Cas8 和 crRNA）。 为了进一步阐明AcrIF25作用机制，研究人员解析了AcrIF25以及Cas7:AcrIF25复合体的晶体结构。AcrIF25的N端结构为典型的RHH折叠，C端由5个α-螺旋形成螺旋束。AcrIF25的C端结构域与Cas7形成大面积的相互作用，通过分析完整 Csy 复合体中两个相邻 Cas7 亚基与 crRNA 之间的相互作用，研究人员发现 AcrIF25结合Cas7的区域覆盖了Csy 复合体中相邻Cas7之间的结合界面以及Cas7与crRNA的结合界面，AcrIF25正是通过结合这些关键位置从而阻止Cas7与其他Cas7亚基和crRNA相互作用，进而使得整个复合体解体。这种“拆除”效应使得CRISPR-Cas系统无法有效地识别并切割外源DNA。 此外，以前发现的能够解离大分子复合体的蛋白质需要利用ATP 水解提供的能量。而AcrIF25不包含ATP结合或水解相关的结构域，生化实验显示，AcrIF25将Cas7从Csy复合体中解离出来不需要水解ATP提供额外的能量，显示了AcrIF25机制的独特性。 综上所述，AcrIF25的发现不仅为理解CRISPR-Cas系统的抑制机制提供了新的见解，而且为开发新型的生物技术工具提供了重要的启示。随着对AcrIF25及其类似Acr蛋白的进一步研究，有望开发出更加高效、安全和可控的基因编辑和基因治疗技术。
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  • 《Science丨揭示真核生物焦亡蛋白GSDM非酶切依赖的全新激活机制》
    • 来源专题：战略生物资源
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2024-04-29
    • 2024年4月25日，中国科学院生物物理研究所丁璟珒课题组和北京生命科学研究所邵峰团队合作，在 Science 期刊发表了题为Cleavage-independent activation of ancient eukaryotic gasdermins and structural mechanisms 的研究论文，该研究揭示了两种来源于低等真核生物的GSDM蛋白通过非蛋白酶切割的新颖方式激活的分子机制。 研究人员首先通过序列同源性分析发现，最原始的多细胞生物丝盘虫（Trichoplax adhaerens）的基因组编码了一个只含有膜打孔结构域的GSDM同源蛋白（TrichoGSDM）。通过重组表达和纯化鉴定，发现TrichoGSDM蛋白同时存在单体和二聚体两种形式，其中单体蛋白具有在脂质体上打孔的活性，TrichoGSDM二聚体则不能上膜打孔。研究人员进一步解析了TrichoGSDM二聚体高分辨率的晶体结构，意外地发现TrichoGSDM二聚体是由两个单体蛋白通过三对分子间二硫键交联而成。在体外利用还原剂处理TrichoGSDM二聚体，或者突变参与二硫键形成的Cys都可以获得均一的单体蛋白，并展示出强烈的膜打孔活性，这表明二硫键连接的二聚体代表了TrichoGSDM蛋白的非激活状态，二聚体向还原态的单体转换可能是TrichoGSDM蛋白潜在的激活机制。细胞质中的谷胱甘肽（glutathione，GSH）和硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）是两种重要的抗氧化系统，可以清除胞质中有害的活性氧或者蛋白质错误氧化形成的二硫键，维持胞质的还原环境。 研究人员利用胞质生理浓度的GSH或丝盘虫的TRX蛋白处理TrichoGSDM二聚体，都可以将二聚体还原、释放单体的膜打孔活性，在细菌中诱导表达TrichoGSDM具有和哺乳动物GSDM蛋白N端结构域相似的抑菌活性，说明细菌胞质的还原环境有利于TrichoGSDM维持在活化的单体状态，通过在细菌膜上打孔抑制细菌生长。研究人员还成功解析了TrichoGSDM在脂质体膜上形成的分子孔道高分辨率的冷冻电镜结构，发现TrichoGSDM由44个单体形成了目前已知的真核生物最大的GSDM孔道。通过结构分析揭示了TrichoGSDM识别酸性磷脂、发生构象变化并寡聚组装成孔的结构基础。这些研究阐明了TrichoGSDM从分子间二硫键介导的二聚体自抑制状态，通过还原二硫键活化成具有打孔活性的单体状态，并进一步在膜上寡聚打孔介导细胞死亡的分子机制，这种新颖的激活机制在GSDM蛋白中是首次发现的。 TrichoGSDM的发现激发了研究人员继续探寻只含有膜打孔结构域的GSDM蛋白的研究兴趣。最近，在丝状真菌粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中发现的融合致死基因rcd-1，在不同菌株中的等位基因可编码RCD-1-1和RCD-1-2两种同源蛋白，当不同菌株发生细胞融合时，两种RCD-1蛋白介导了同种异体识别（allorecognition）引发的细胞死亡。研究人员通过解析RCD-1-1和RCD-1-2的晶体结构，发现两种RCD-1蛋白与哺乳动物GSDM的膜打孔结构域具有相似的结构特征，但二者缺少发挥自抑制功能的结构元件。单独的RCD-1-1或RCD-1-2在溶液中呈现单体状态，通过识别酸性磷脂结合在脂质体膜上，却无法寡聚打孔，因而没有细胞毒性。而两种RCD-1蛋白在大肠杆菌、酿酒酵母或HeLa细胞等多种细胞系统中共表达时，会引发强烈的裂解性细胞死亡。 通过解析共孵育的RCD-1-1和RCD-1-2蛋白在脂质体膜上形成的分子孔道冷冻电镜三维结构，发现两种蛋白通过交替排布的异源寡聚组装方式形成已知的最小GSDM孔道。分析RCD-1分子孔道中两种蛋白的作用方式发现，每一个RCD-1-1分子都与两侧相邻的RCD-1-2分子相互作用，但两侧的互作方式并不等效，拥有更强分子间极性作用的一侧主导了RCD-1异源二聚体的形成，而另一侧的分子间相互作用驱动了以异源二聚体为单元进一步寡聚成孔。将RCD-1-1和RCD-1-2蛋白与脂质体共孵育，或分别结合脂质体后再进行共孵育，都可以通过两种蛋白的分子间识别激活在脂质体膜上的打孔活性，而将异源二聚体识别界面的关键残基突变，在分别表达两种蛋白的不同交配型酵母细胞融合或不同粗糙脉孢菌菌株的孢子融合时，都阻断了RCD-1蛋白的分子间识别，因而不能激活膜打孔活性并引起裂解性细胞死亡。这些研究揭示了具有膜结合特性的RCD-1蛋白单独存在时处在未激活的静息状态，细胞融合导致两种蛋白相遇，通过分子间特异性识别来激活异源二聚体组装，并进一步在细胞膜上寡聚成孔，执行细胞死亡的功能。 上述研究打破了一直以来认为GSDM蛋白需要蛋白酶切割打开自抑制、激活膜打孔活性的传统认识，揭示了低等真核生物中两类只含有膜打孔结构域的GSDM蛋白，分别通过氧化还原调控或配对的分子间相互作用来释放膜打孔活性的全新激活机制，拓展了对GSDM蛋白进化和功能多样性的机制理解。多种不同的激活机制表明GSDM蛋白可以响应更广泛的生物学信号，参与更丰富的生命活动过程。同时，这种不依赖酶切的GSDM蛋白具有被开发成诱导细胞死亡新型工具的潜力，可以助力细胞焦亡相关的基础和转化研究。
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