《Science丨揭示真核生物焦亡蛋白GSDM非酶切依赖的全新激活机制》

  • 来源专题:战略生物资源
  • 编译者: 李康音
  • 发布时间:2024-04-29
  • 2024年4月25日,中国科学院生物物理研究所丁璟珒课题组和北京生命科学研究所邵峰团队合作,在 Science 期刊发表了题为Cleavage-independent activation of ancient eukaryotic gasdermins and structural mechanisms 的研究论文,该研究揭示了两种来源于低等真核生物的GSDM蛋白通过非蛋白酶切割的新颖方式激活的分子机制。

    研究人员首先通过序列同源性分析发现,最原始的多细胞生物丝盘虫(Trichoplax adhaerens)的基因组编码了一个只含有膜打孔结构域的GSDM同源蛋白(TrichoGSDM)。通过重组表达和纯化鉴定,发现TrichoGSDM蛋白同时存在单体和二聚体两种形式,其中单体蛋白具有在脂质体上打孔的活性,TrichoGSDM二聚体则不能上膜打孔。研究人员进一步解析了TrichoGSDM二聚体高分辨率的晶体结构,意外地发现TrichoGSDM二聚体是由两个单体蛋白通过三对分子间二硫键交联而成。在体外利用还原剂处理TrichoGSDM二聚体,或者突变参与二硫键形成的Cys都可以获得均一的单体蛋白,并展示出强烈的膜打孔活性,这表明二硫键连接的二聚体代表了TrichoGSDM蛋白的非激活状态,二聚体向还原态的单体转换可能是TrichoGSDM蛋白潜在的激活机制。细胞质中的谷胱甘肽(glutathione,GSH)和硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)是两种重要的抗氧化系统,可以清除胞质中有害的活性氧或者蛋白质错误氧化形成的二硫键,维持胞质的还原环境。

    研究人员利用胞质生理浓度的GSH或丝盘虫的TRX蛋白处理TrichoGSDM二聚体,都可以将二聚体还原、释放单体的膜打孔活性,在细菌中诱导表达TrichoGSDM具有和哺乳动物GSDM蛋白N端结构域相似的抑菌活性,说明细菌胞质的还原环境有利于TrichoGSDM维持在活化的单体状态,通过在细菌膜上打孔抑制细菌生长。研究人员还成功解析了TrichoGSDM在脂质体膜上形成的分子孔道高分辨率的冷冻电镜结构,发现TrichoGSDM由44个单体形成了目前已知的真核生物最大的GSDM孔道。通过结构分析揭示了TrichoGSDM识别酸性磷脂、发生构象变化并寡聚组装成孔的结构基础。这些研究阐明了TrichoGSDM从分子间二硫键介导的二聚体自抑制状态,通过还原二硫键活化成具有打孔活性的单体状态,并进一步在膜上寡聚打孔介导细胞死亡的分子机制,这种新颖的激活机制在GSDM蛋白中是首次发现的。

    TrichoGSDM的发现激发了研究人员继续探寻只含有膜打孔结构域的GSDM蛋白的研究兴趣。最近,在丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中发现的融合致死基因rcd-1,在不同菌株中的等位基因可编码RCD-1-1和RCD-1-2两种同源蛋白,当不同菌株发生细胞融合时,两种RCD-1蛋白介导了同种异体识别(allorecognition)引发的细胞死亡。研究人员通过解析RCD-1-1和RCD-1-2的晶体结构,发现两种RCD-1蛋白与哺乳动物GSDM的膜打孔结构域具有相似的结构特征,但二者缺少发挥自抑制功能的结构元件。单独的RCD-1-1或RCD-1-2在溶液中呈现单体状态,通过识别酸性磷脂结合在脂质体膜上,却无法寡聚打孔,因而没有细胞毒性。而两种RCD-1蛋白在大肠杆菌、酿酒酵母或HeLa细胞等多种细胞系统中共表达时,会引发强烈的裂解性细胞死亡。

    通过解析共孵育的RCD-1-1和RCD-1-2蛋白在脂质体膜上形成的分子孔道冷冻电镜三维结构,发现两种蛋白通过交替排布的异源寡聚组装方式形成已知的最小GSDM孔道。分析RCD-1分子孔道中两种蛋白的作用方式发现,每一个RCD-1-1分子都与两侧相邻的RCD-1-2分子相互作用,但两侧的互作方式并不等效,拥有更强分子间极性作用的一侧主导了RCD-1异源二聚体的形成,而另一侧的分子间相互作用驱动了以异源二聚体为单元进一步寡聚成孔。将RCD-1-1和RCD-1-2蛋白与脂质体共孵育,或分别结合脂质体后再进行共孵育,都可以通过两种蛋白的分子间识别激活在脂质体膜上的打孔活性,而将异源二聚体识别界面的关键残基突变,在分别表达两种蛋白的不同交配型酵母细胞融合或不同粗糙脉孢菌菌株的孢子融合时,都阻断了RCD-1蛋白的分子间识别,因而不能激活膜打孔活性并引起裂解性细胞死亡。这些研究揭示了具有膜结合特性的RCD-1蛋白单独存在时处在未激活的静息状态,细胞融合导致两种蛋白相遇,通过分子间特异性识别来激活异源二聚体组装,并进一步在细胞膜上寡聚成孔,执行细胞死亡的功能。

    上述研究打破了一直以来认为GSDM蛋白需要蛋白酶切割打开自抑制、激活膜打孔活性的传统认识,揭示了低等真核生物中两类只含有膜打孔结构域的GSDM蛋白,分别通过氧化还原调控或配对的分子间相互作用来释放膜打孔活性的全新激活机制,拓展了对GSDM蛋白进化和功能多样性的机制理解。多种不同的激活机制表明GSDM蛋白可以响应更广泛的生物学信号,参与更丰富的生命活动过程。同时,这种不依赖酶切的GSDM蛋白具有被开发成诱导细胞死亡新型工具的潜力,可以助力细胞焦亡相关的基础和转化研究。

  • 原文来源:https://www.science.org/doi/10.1126/science.adm9190
相关报告
  • 《Science:揭示蛋白BAF阻止细胞攻击自身DNA机制》

    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2020-08-18
    • 病毒通过将其DNA注入宿主细胞进行增殖。一旦它进入细胞内液体,这种外来物质就会触发一种称为cGAS-STING途径的防御机制。一种称为环GMP-AMP合酶(cGAS)的蛋白也存在于液体内,它与入侵的DNA结合,产生一种新分子。这接着又与另一种叫做STING的蛋白结合,从而诱发炎症免疫反应。 有时,液体内所含的物质--以及与cGAS蛋白接触的物质--不是来自病毒,而是来自细胞本身,比如细胞核意外破裂后。当这种情况发生时,cGAS-STING途径并没有被激活。 如今,在一项新的研究中,来自瑞士洛桑联邦理工学院(EPFL)的研究人员证实了细胞如何对自己的DNA和来自病原体的遗传物质作出不同的反应,从而避免攻击错误的靶标。他们的发现为人体炎症反应中发生的复杂过程提供了新的见解。相关研究结果发表在2020年8月14日的Science期刊上,论文标题为“BAF restricts cGAS on nuclear DNA to prevent innate immune activation”。论文通讯作者为瑞士洛桑联邦理工学院的Andrea Ablasser教授。 Ablasser教授及其团队针对一种称为Barrier-to-Autointegration Factor(BAF)的小蛋白的关键作用提出了新的见解。他们发现,通过与无害的DNA结合,BAF阻止cGAS蛋白结合DNA,从而阻止cGAS-STING途径激活。 BAF可以增强细胞核的功能,将核膜与内部的DNA连接起来。实验表明,当将这种蛋白从实验室生长的细胞中移除时,细胞核会破裂。这种破裂将遗传物质释放到细胞内液中,在那里遗传物质与cGAS蛋白接触,并触发cGAS-STING途径,就像它是外来DNA一样。 导致细胞核破裂的方法有很多种,比如施加机械压力。不过根据论文共同第一作者Baptiste Guey的说法,仅其中的一种方法---移除BAF蛋白---能引起免疫反应。Guey说,“因此,我们可以得出结论,BAF在防止细胞攻击自己的DNA方面起着关键作用。” 这种蛋白的抑制作用极为重要:虽然cGAS-STING途径帮助身体抵御感染,但它也需要受到控制。论文共同第一作者Marilena Wischnewski说,“细胞核偶尔会破裂,但细胞能够修复损伤。如果cGAS每次都与DNA结合,后果会更严重。” 过度活跃的cGAS-STING途径的危害可以在Aicardi-Goutières综合征中观察到。这种种罕见且通常是致命的遗传性疾病会诱发过度的炎症反应,就像身体的细胞不断受到入侵病原体的攻击一样。 BAF也被认为在某些类型的肿瘤中起作用。根据Wischnewski的说法,癌细胞中高浓度的BAF可能与较差的预后有关。她解释说,“这可能是BAF让肿瘤更具抵抗力。通过防止cGAS-STING途径的激活,它可能会让癌细胞逃避身体的免疫系统。” 这种蛋白在不同类型的细胞中以不同数量存在。这些研究人员计划深入研究这些数量变化,这是因为他们试图了解不同组织类型如何应对感染和炎症。
  • 《生物物理所等揭示细菌效应蛋白拮抗宿主细胞焦亡通路的分子机理》

    • 来源专题:转基因生物新品种培育
    • 编译者:姜丽华
    • 发布时间:2023-02-08
    • 细胞焦亡作为机体重要的天然免疫反应,在拮抗和清除病原菌感染中发挥关键作用。当革兰氏阴性菌侵入宿主细胞后,其外膜的重要病原分子模式LPS(脂多糖,也称内毒素)会被宿主细胞内的天然免疫受体caspase-4/5/11识别,LPS激活的caspase-4/5/11会进一步切割活化焦亡蛋白GSDMD释放其膜打孔活性,导致细胞焦亡,激发宿主的抗菌炎症反应。同时,细菌也采用了多种策略来逃避宿主的免疫防御,例如通过独特的III型分泌系统向宿主细胞“注入”专门的效应蛋白,干扰宿主的免疫防御通路。2021年,北京生命科学研究所邵峰团队发现痢疾杆菌(Shigella)分泌的效应蛋白OspC3可以特异识别宿主细胞内的天然免疫受体caspase-4/11,通过催化caspase酶活中心的关键精氨酸发生一种全新的ADP-riboxanation翻译后修饰使caspase-4/11失活,阻断其活化下游GSDMD介导的细胞焦亡免疫防御。然而效应蛋白OspC3是如何特异地识别宿主靶标caspase-4/11,又是如何催化新颖的ADP-riboxanation修饰拮抗细胞焦亡的精确分子机理等关键科学问题有待进一步回答。   近日,中国科学院生物物理研究所王大成/丁璟珒课题组和邵峰团队合作,在Nature Structural & Molecular Biology发表题为Structural mechanisms of calmodulin activation of Shigella effector OspC3 to ADP-riboxanate caspase-4/11 and block pyroptosis的研究论文。该研究揭示了效应蛋白OspC3利用宿主细胞的钙调蛋白(calmodulin,CaM)作为辅助因子激活其酶学活性,特异地识别宿主靶标caspase-4/11并催化全新的精氨酸ADP-riboxanation修饰,阻断宿主细胞caspase-4/11-GSDMD焦亡通路的完整分子机理。   研究人员发现OspC3可以有效地对静息状态未发生自剪切的caspase-4/11和细菌LPS激活后发生自剪切的caspase-4/11两种形式进行修饰,但是激活形式的caspase-4/11活性中心如果被模拟底物切割位点四肽序列的共价抑制剂zVAD不可逆地占据,会极大地削弱OspC3对caspase-4/11的修饰,这表明底物非结合状态的caspase-4/11,不论激活与否都是OspC3的底物。研究人员发现,ADP-核糖基特异性结合蛋白Af1521可与修饰后的caspase-4/11产物形成稳定的1:1复合物,通过解析Af1521与caspase-4被修饰后产物的复合物的高分率晶体结构,研究人员清晰地观察到ADP-riboxanation修饰的精确化学结构,caspase-4修饰位点R314的侧链胍基脱去一个末端Nω原子后与来自NAD+的ADP-核糖基核糖环上的C1原子和C2位羟基分别连接,形成了一个全新的五元恶唑烷环,该结果为精氨酸ADP-riboxanation这种全新的翻译后修饰提供了直接的结构证明。   OspC3及其所属的细菌效应蛋白家族具有典型的双结构域特征,其N端结构域和任何已知的蛋白质没有序列同源性,而C端包含一个保守的ankyrin-repeat结构域(ARD),这类结构域通常介导蛋白质相互作用,因此推测该结构域是OspC3的底物识别结构域。研究人员进一步通过解析OspC3 ARD结构域与caspase-4底物复合物的晶体结构,确定了OspC3 ARD结构域通过一系列氢键网络和疏水作用特异地招募宿主靶标caspase-4/11。   在体外重组OspC3修饰caspase-4/11的酶活实验中,研究人员发现OspC3需要几乎与底物蛋白caspase-4/11相当的量才能实现对底物的完全修饰,这有悖于酶催化底物反应高效性的经典认识。通过免疫共沉淀结合质谱的方法,研究人员鉴定出宿主的钙调蛋白CaM以Ca2+-free的形式与OspC3形成稳定的二元复合物,极大提高了OspC3的催化效率。研究人员解析了OspC3与CaM二元复合物的高分辨率晶体结构,发现Ca2+未结合状态的CaM通过两个亚结构域分别以广泛的疏水作用牢牢抓住OspC3的N端结构域,而OspC3的N端结构域呈现出经典Rossmann折叠构象,与已知的ADP-核糖基转移酶结构域具有相似的结构特征和保守的NAD+结合基序。为了进一步阐明OspC3利用NAD+作为供体催化caspase-4/11的精氨酸发生ADP-riboxanation修饰的完整酶学机理,研究人员解析了OspC3-CaM-caspase-4三元复合物及其与2'-F-NAD+(非水解型NAD+类似物)的四元复合物晶体结构,发现OspC3的N端的酶活中心通过酸性氨基酸D231固定caspase-4活性中心R314侧链胍基的末端Nω原子,使ADP-核糖基C1位靠近R314胍基的Nδ原子,从而利于NAD+烟酰胺基团的离去和在修饰位点R314 Nδ原子上发生第一步经典的ADP-核糖基修饰;而酶活中心的另一个酸性氨基酸D177则负责激活ADP-核糖基C2位的羟基亲核进攻R314侧链胍基C原子发生脱氨反应,使精氨酸侧链胍基和ADP-核糖基团形成一个恶唑烷环。研究人员将结构研究的发现利用定点突变的方法在生化、细胞和Shigella感染小鼠三个层面进行了验证,完整地阐明了OspC3利用宿主辅因子CaM特异地对caspase-4/11进行精氨酸ADP-riboxanation修饰的分子机理。   该研究通过一系列三维结构分析与功能实验验证,揭示了痢疾杆菌效应蛋白OspC3特异地识别宿主天然免疫受体caspase-4/11,并利用宿主钙调蛋白CaM作为辅因子催化全新的精氨酸ADP-riboxanation修饰,阻断宿主细胞caspase-4/11-GSDMD焦亡防御通路的完整分子机理,也为ADP-riboxanation这种全新的翻译后修饰的酶学反应机理提供了全面深入的理解,为进一步寻找和开发新型抗菌药物或细菌减毒疫苗提供了新策略。   相关研究工作得到中国科学院战略性先导科技专项、科学技术部重点研发计划、中国科学院青年创新促进会项目等的支持。