《Nature子刊:一种疾病蛋白对产生新的溶酶体至关重要》

  • 来源专题:重大疾病防治
  • 编译者: 蒋君
  • 发布时间:2023-08-31
  • 神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)是一组破坏性的神经退行性溶酶体储存疾病,开始于儿童时期。CLN3基因突变导致一种被称为巴顿病的NCL,其特征是视力、运动和认知能力的逐渐丧失。目前还没有针对这些疾病的有效治疗方法,因为大多数导致这些疾病的基因的生物学作用还没有很好地定义。美国贝勒医学院和德克萨斯儿童医院、意大利Telethon遗传与医学研究所和Federico II大学的研究人员发现CLN3对溶酶体生物发生和自噬溶酶体重组(ALR)至关重要,揭示了巴滕病的一种新的发病机制。
  • 原文来源:http://www.ebiotrade.com/newsf/2023-7/20230707030956404.htm
相关报告
  • 《《科学》子刊:科学家首次证实,新冠病毒S蛋白竟是溶酶体蛋白!》

    • 来源专题:生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2022-12-26
    • 新冠疫情爆发至今已经三年,虽然奥密克戎致病性有所减弱,但新冠病毒仍在快速变异,而变异主要集中在S蛋白。因此,破解S蛋白核心变异对新冠病毒进出细胞的影响,对新冠病毒溯源、抗体疗法、疫苗设计尤其重要。 近日,由约翰·霍普金斯大学医学院Stephen Gould教授领衔的研究团队,在著名期刊Science Advances发表重要研究成果【1】。该论文的第一作者是郭晨栩,通讯作者是Stephen Gould,其他研究人员包括蔡尚睿、Yiwei Ai、Maggie Li、Eduardo Anaya、Andrew Pekosz和Andrea Cox。 通过研究新冠病毒S蛋白在细胞内的转运,Gould团队发现S蛋白是一种溶酶体蛋白,2020年初出现并迅速占据主导地位、成为所有毒株共有的D614G突变并不是对人类宿主的适应。相反,D614G的出现纠正了由早期弗林蛋白酶切割位点插入(FCSI)突变所引起的一系列S蛋白功能缺陷,包括S蛋白向溶酶体的运输。 Gould团队2020年底曾在预印平台biorxiv上刊登过相关研究结果【2】,是世界首篇提供明确证据表明S蛋白能够重塑溶酶体结构和功能的论文,进一步支持以溶酶体为核心的β冠状病毒进出细胞的机理模型,并揭示了D614G突变作为基因内抑制因子,在新冠病毒进化、免疫、预防、治疗等方面的重要意义。 S蛋白是抗击新冠病毒最关键的蛋白质,因为它识别并介导受体结合,促进病毒进入细胞,依然是绝大多数疫苗的唯一抗原和抗体疗法的首要目标,而且它还一直在快速变异。 不同于其他SARS相关冠状病毒,新冠病毒在其起源之时或之前获得了FCSI突变,使S蛋白能被弗林蛋白酶介导的加工预先激活,以便其他丝氨酸蛋白酶如TMPRSS2进行切割,为新冠病毒提供了一种新的、不依赖于胞内体/溶酶体的入侵机制去感染细胞,从而使新冠病毒能够通过呼吸系统快速、有效地传播。 尽管FCSI增加了新冠病毒可以采用的感染机制、可以识别的受体范围、可以感染的细胞类型以及可以传播的途径和效率,但也引起了S蛋白结构的显著变化。由于改变结构的变异几乎总会伴随一些不利的副作用,FCSI会带来有害的特性也就不足为奇了。具体而言,FCSI导致内体/溶酶体感染途径出现重大缺陷,新冠病毒在缺乏TMPRSS2表达的VeroE6等细胞系中复制不良,在连续传代后,迅速出现FCSI逆转突变体【3-7】。 疫情开始不久,新冠病毒便获得了另一个有利的变异(D614G突变)。这是新冠病毒在人群中传播后出现的第一个变异,也是后来所有毒株共同拥有的变异。它显著增强了新冠病毒的感染力、传播性和病毒载量,奇点网此前也曾多次报道。 一般来说,病毒会朝着减少其细胞表面表达的方向进化,这可能是因为适应性免疫反应定向选择了能够更好地逃避免疫监视的突变病毒。为了检测D614G是否能够减少S蛋白在细胞膜上的表达,研究人员把新冠病毒原始毒株(WT)和D614G突变株的S蛋白克隆出来,分别整合到一个由四环素操纵子调控的基因表达体系中,并通过两个不同的对照实验(生物素细胞表面标记结合亲和素亲和层析分离,以及细胞表面荧光标记流式细胞术)发现,D614G使细胞膜S蛋白的表达量降低至原来的三成水平,而这两种S蛋白的总表达量相似。 众所周知,蛋白质在细胞内的转运是一场零和博弈。鉴于S/WT和S/D614G的总表达水平相似,既然D614G使其在细胞膜的表达量减少了70%,那么它一定是被运输到了细胞内部。 研究人员通过分析早期新冠患者的血浆,利用不同患者产生的抗体,追踪S蛋白在细胞内的转运。果然,他们在表达S/WT的细胞中发现了强烈的细胞表面信号,而在表达S/D614G的细胞中找到了更多的细胞内部定位。有趣的是,S/WT显示出大量与高尔基体标记物GM130荧光共定位,而S/D614G则高度集中在多个大型非高尔基体细胞器中。 此前曾有多则报道,β冠状病毒能将宿主细胞的溶酶体转化为病毒储存和释放的容器,所以新合成的β冠状病毒颗粒不是通过经典分泌途径释放的,而是被运输到溶酶体并在那里不断积累,直到被溶酶体胞吐作用大量释放。 为了确定S/D614G高度集中的细胞器是否就是溶酶体,研究人员做了一系列实验,包括免疫荧光显微、免疫金电子显微技术等,证实了(1)S蛋白是一种溶酶体蛋白并能引起溶酶体聚集,(2)D614G将S蛋白从细胞膜重定向到溶酶体限制膜上,(3)与S/WT相比,D614G导致更多的S蛋白(约1.5倍)转运到溶酶体上。 研究人员接下来测试了D614G在新冠病毒感染的情况下,是否也会影响S蛋白在细胞内的转运。他们分别用原始毒株和D614G突变株感染Vero E6/TMPRSS2细胞,用免疫荧光显微镜和流式细胞术等方法分析,得到了相似的结果。 至于新冠病毒为什么会发生D614G突变,研究人员认为,该突变出现的时间和重复、独立的起源表明,它的产生正是为了适应新冠病毒进化历程中相对较新的事件,而在新冠病毒的近期历史/史前历史中只发生了两起重大事件:由动物传染到人类,以及新冠病毒特有的FCSI变异。由此推理,D614G出现的原因有两种可能,一种是对其新宿主人类的进化适应,另一种是为了修正先前FCSI所带来的不利影响而产生的进化适应。 研究人员首先在进化史上距离人类较远的哺乳动物负鼠的细胞中表达了S/WT和S/D614G两种蛋白,并测量了S蛋白的总表达量和在细胞表面的表达水平,得出了与之前一致的结论,从而排除了“D614G是人类特有的进化适应”这一可能性。 接下来,Gould团队根据几组不同的实验发现,抑制弗林蛋白酶或破坏FCSI,确实恢复了S蛋白向溶酶体运输的能力,而弗林蛋白酶介导的S蛋白切割,导致S蛋白转运至溶酶体的功能出现明显缺陷,并使细胞表面S蛋白的表达量增加约3倍。研究人员认为,D614G通过还原S蛋白向溶酶体运输的能力,抑制了S蛋白转运中与FCSI相关的有害特性。 在后续的实验里,研究人员利用遗传学方法发现,S蛋白向溶酶体的转运是由其细胞外结构域调节的。此外,Gould团队基于多个对照试验,提供了首个明确证据表明,仅仅依靠S蛋白的表达就足以驱动溶酶体聚集、KDEL受体在溶酶体积累、ER驻留蛋白的异常分泌,甚至可能阻断内吞物质的溶酶体摄取。 总的来说,从细胞生物学的角度,Gould团队首次证实新冠病毒S蛋白是一种溶酶体蛋白,在β冠状病毒感染的细胞中,除了受体结合、膜融合以外,还能改变溶酶体的结构并重塑溶酶体的功能。 从新冠病毒进化的角度,Gould团队的研究成果表明,最早出现的两个突变,FCSI和D614G,在功能上是密切相关的。D614G突变的出现是为了修复FCSI引起的不良副作用而发生的进化适应,同时依然允许弗林蛋白酶切割S蛋白并支持新冠病毒在呼吸系统传播。 Gould团队强调,新冠研究应该拓宽考虑S蛋白突变的遗传和功能背景,虽然所有S蛋白突变都可能代表对其环境的适应,但也有可能是对先前突变的适应。除了研究S蛋白突变对其受体结合、膜融合催化能力的作用,还应该关注这些突变对S蛋白在宿主细胞内的转运及其对S蛋白介导的溶酶体重编程的影响。 参考文献 1.https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade5085 2.https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.08.417022v1 3.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32571797/ 4.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32568027/ 5.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33476327/ 6.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33835028/ 7.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34159616/
  • 《Nature子刊 (细胞死亡和疾病):一种p53异形体调节条件性细胞重编程》

    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2018-07-25
    • 肿瘤抑制蛋白p53是一种序列特异性转录因子,通过抑制或激活下游的靶基因来调节细胞增殖和凋亡。功能性p53的缺乏导致致瘤性转化, p53基因的突变也是目前人恶性肿瘤中最常见的基因变异之一, 40多年来一直是肿瘤研究领域中最重要和最活跃的分子之一。近几年来,科学家们对p53的异形体越来越多。迄今为止,人们已鉴定出14种天然的p53异形体(isoform):p53α、p53β、p53γ、Δ40p53α、Δ40p53β、Δ40p53γ、Δ133p53α、Δ133p53β、Δ133p53γ、Δ160p53α、Δ160p53β、Δ160p53γ、Δp53和 p53ψ,而且其中的很多p53异形体能够导致不同的生物学表型。 尽管野生型全长p53的功能已得到很好的确定,但是各种p53异形体在衰老、生长率和凋亡中的生理作用以一种复杂的经常明显存在冲突的方式关联在一起。美国乔治城大学医学中心细胞重编程实验室主任、细胞永生化科学家,病理学系刘学锋(Xuefeng Liu)教授及其同事们之前已在体内和体外证实两种p53异形体---Δ133p53α和p53β---潜在地调节人细胞的增殖并可能调节细胞重编程。 在一项最新发表在Nature子刊(细胞死亡和疾病)的研究[1]中,刘学锋教授及其团队报道了一种以前未有见过报道的有关Δ133p53α新功能----调节条件性细胞重编程过程和端粒酶的活性。利用他们在2011年开发出的条件性重编程细胞(conditional reprogramming cell, CRC)技术对两种在体外培养时具有有限增殖寿命(replicative lifespan)的原代人细胞---从新生儿包皮中分离出的人包皮角化细胞(human foreskin keratinocyte, HFK)和从正常的成年人前列腺组织中分离出的人前列腺上皮细胞(human prostate epithelial cell, HPEC)---进行条件性重编程,结果证实Δ133p53α在这些条件性重编程的HFK和HPEC细胞中调节细胞增殖。过度表达Δ133p53α一致性地延缓细胞衰老并且让原代培养的HFK和HPEC细胞在一种Rho相关激酶(ROCK)抑制剂的存在下能够在体外无限地增殖(如图1所示)。这种Δ133p53α延长的细胞增殖寿命涉及上调hTERT表达和它的端粒酶活性。 鉴于这种CRC技术发挥的重要作用,那么到底什么是CRC技术呢?让我们先回顾一下这个领域的研究背景。 在此之前,绝大多数癌细胞系是利用高分级或转移性肿瘤建立的,而且其中的不少癌细胞系经证实与其来源的肿瘤存在遗传上的不同。大多数原代细胞系具有有限的增殖次数,最终都因细胞衰老而具有有限的寿命。迄今为止,科学家们利用了多种方法来维持原代细胞的增殖能力。 一种可能是最为常见的维持方法是利用病毒癌基因转化原代细胞。特别地,利用SV40大T抗原或致癌性人乳头瘤病毒E6/E7蛋白的编码基因加以转化能够导致很多类型的细胞永生化。但是,这种基因操纵导致基因组不稳定,因此在经过几次传代后,体外培养的转化细胞渐进性地积累着基因组变异,这就会导致它们具有不同于它们起源的原代细胞的表型,比如可能具有异常的p53和Rb调节通路。 另一种永生化方法让一些原代细胞表达人端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)等外源性细胞基因就能够阻止它们的染色体变短,让它们逃避细胞衰老,从而导致永生化。尽管过度表达hTERT并不会导致正常的细胞发生癌变,但是所形成的细胞在经过多次传代后也表现出异常的细胞特性。 此外,通过导入外源性基因让皮肤细胞或血细胞等体细胞退回到一种类似于胚胎干细胞的状态,所形成的细胞被称作诱导性多能干细胞(iPS细胞)。这种ips细胞技术也能够延长细胞寿命,但是它的效率相对较低,而且导入外源性基因会诱导细胞基因组发生变化,甚至可能诱发肿瘤产生。 针对现有技术的这些缺点,2010年,刘学锋教授等人发现在体外利用ROCK抑制剂Y-27632处理三种人原代角化细胞---人新生儿包皮角化细胞、成年人阴道角化细胞和成年人子宫颈外角化细胞(ectocervical keratinocyte)---能够极大地增加这些在体外培养时具有有限寿命的人原代角化细胞的增殖能力,高效地导致它们永生化[2]。更重要的是,这些永生化细胞表现出典型的原代角化细胞特征,而且它们具有正常的二倍体核型和完整的DNA损伤反应,此外还能够经分化后产生复层上皮(stratified epithelium)。这有助于研究很多不同的皮肤上皮和黏膜上皮疾病的致病过程。 在此基础上,刘学锋教授等人在2011年底发现组合使用ROCK抑制剂Y-27632和经过照射的小鼠成纤维细胞(作为饲养细胞层)可诱导来自人体很多组织(比如前列腺和乳腺)的正常上皮细胞和肿瘤上皮细胞在体外无限地增殖,而无需导入外源性的病毒基因或细胞基因[3],如图2所示。在这种生长条件下,在5至6天内可从针刺活组织中培养出2 × 106个细胞,能够从低温保存的组织中培养出大量的细胞,而且还能够利用不到4个活细胞培养出大量的细胞。持续的细胞增殖依赖于饲养细胞和Y-27632,因此将这种组合使用产生的细胞称为条件性重编程细胞(conditionally reprogrammed cell, CRC)。此外,这些CRC细胞保持正常的二倍体核型,而且没有致癌性。这种CRC技术也适用于来自人类和啮齿类动物的肿瘤上皮细胞。 也正是这种CRC技术具有以上优点,它一经问世就引发人们的极大关注,并被全世界不少实验室采用。基于此,刘学锋教授等人在2017年将这种CRC技术的详细步骤发布在Nature Protocols期刊[4]上,供人们参考。 谈了这么多,那么CRC方法的作用机制什么呢?或者说,在这种方法中,作为饲养细胞的小鼠成纤维细胞和Y-27632到底起着什么作用呢? 针对这一点,美国耶鲁大学医学院的Seema Agarwal和David L. Rimm在一篇评论文章中进行了总结[5]。在这种CRC方法中,经过照射而没有增殖能力的成纤维细胞诱导和维持原代上皮细胞表达hTERT。这种影响很可能是通过细胞间的直接相互作用或者通过分泌可扩散的生长因子和细胞因子(比如IL-6、HGF和TGFβ等)加以实现的。它也可能是通过提供一种不可溶的胞外基质(ECM)或者通过分泌ECM重塑蛋白(比如MMP-9和MMP-3)加以调节的。 经过照射的非增殖性成纤维细胞分泌的生长因子、细胞因子和ECM重塑蛋白的不确定性组合似乎在维持与饲养细胞和Y-27632一起培养的原代上皮细胞的不受限制的增殖潜力中起着至关重要的作用。此外,另一个潜在地影响这种无限制增殖的变量是将小鼠成纤维细胞用作饲养细胞的事实。尽管这些小鼠成纤维细胞分泌的蛋白因子可能与人细胞产生的蛋白因子是相类似的,但非人细胞微环境对人原代上皮细胞的影响仍未得到充分理解。 这种CRC方法的另一个关键部分是使用一种ROCK抑制剂来协助维持原代上皮细胞的未分化状态和增殖状态。尽管这种ROCK抑制剂的使用不是新的,但是它与饲养细胞的组合使用似乎在阻止这些体外培养的细胞衰老方面起着关键性的作用。 为了验证这一点,刘学锋教授等人[3]通过对起源自正常的前列腺和乳腺组织的上皮细胞进行核型分析,证实它们仍然保持二倍体核型,而且当被注射到小鼠体内时,它们也不会产生肿瘤。因此,刘学锋教授等人[3]证实组合使用经过照射的小鼠成纤维细胞和这种ROCK抑制剂是它们的初期存活和无限制增殖所必不可少的。移除两种组分中的任何一种都会导致所形成的CRC细胞分化,并最终导致细胞衰老。 利用CRC技术实现的成体哺乳动物非角化细胞上皮细胞无限增殖也为基因疗法、细胞疗法、再生医疗和个性化医疗提供令人激动的机会。 比如,2012年,刘学锋教授等人利用CRC方法产生源自一名患者的正常肺部组织和肺部肿瘤组织的细胞培养物[6],其中这名患者患上20年的复发性呼吸道乳头瘤病,并且具有进行性的双侧肿瘤浸润肺实质。分析结果表明喉部肿瘤细胞含有一个长7.9kb的野生型人乳头瘤病毒11型(HPV-11)基因组,而肺部肿瘤细胞含有一个长10.4kb的HPV-11基因组。 肺部肿瘤细胞中的病毒基因组的大小增加是由于它的启动子和致癌基因区域发生复制。化学敏感性测试鉴定出伏立诺他(vorinostat)是一种潜在的治疗药物。在开始治疗3个月后,这名患者的肿瘤大小保持稳定,而且在15个月时,这种效果仍是持续性的。 总之,这种CRC方法具有快速地产生患者来源的原代细胞的巨大潜力,所产生的原代细胞可用于多种用途,包括构建活的生物库,探究基本肿瘤生物学特性,药物靶标识别和药物发现等,如图3所示。特别值得一提的是,今年4月美国国立卫生研究院(NIH)将CRC技术列为两种重要的人源癌症细胞模型之一 (7),作为最接近患者的癌症生物学/精准医学/个体化治疗和新药发现工具之一, NCI执行所长James Doroshow是该项目的倡议和发起人。