Nature Biotechnology杂志发表了题为“The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies”的综述文章，回顾了mRNA疫苗及相关免疫疗法的临床进展。在《Nature深度好文：mRNA疫苗5大优势、7大改进方向……》一文中，我们重点介绍了“预防性mRNA疫苗”相关的内容，本篇将聚焦抗肿瘤mRNA疫苗及基于mRNA的蛋白免疫疗法与细胞免疫疗法。
抗肿瘤mRNA疫苗
肿瘤免疫疗法进展迅速，PD-1、CTLA-4、PD-L1、LAG-3等免疫检查点纷纷有药物获批，产业界研发热情高涨。将mRNA用于肿瘤免疫疗法的原理是利用mRNA编码突变肿瘤抑制蛋白，修饰肿瘤微环境，从而实现治疗目的。该方法的应用受限于mRNA递送技术。按照目前的递送能力，mRNA无法到达患者体内的每一个肿瘤细胞。因此，研发人员越来越关注将mRNA作为治疗性疫苗，诱导免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞。
在新冠mRNA疫苗的研发中，产业界在快速开发和生产mRNA药物、体内编码疾病完整抗原方面获取的经验使得mRNA疫苗技术用于肿瘤治疗很有希望。此外，一些患者对目前的免疫靶向药物耐药，这也为mRNA疫苗用于肿瘤治疗创造了机会。
治疗性疫苗的开发过程有一系列常见的挑战。首先，传染病疫苗通过诱导机体体液免疫实现预防功能，而治疗性肿瘤疫苗还必须能够诱导强烈的CD8+T细胞反应以彻底根除所有肿瘤细胞。其次，开发肿瘤治疗性mRNA疫苗需要在体内编码能够诱导肿瘤高度特异性免疫反应的抗原。由于个体间抗原存在高度变异性，研究人员开发了一系列患者特异性的新抗原以应对这一挑战。最后，即便抗原能够诱导细胞免疫反应，抑制性肿瘤微环境可阻碍T细胞浸润肿瘤组织，甚至可能导致T细胞衰竭，因此治疗性疫苗还需要与克服抑制性肿瘤微环境药物（如免疫检查点抑制剂）联合使用。
1.肿瘤相关抗原
肿瘤相关抗原（TAA）主要分布于肿瘤细胞表面，是免疫系统攻击肿瘤的识别位点。肿瘤疫苗的靶标中包括了多种已知的TTA。
BNT111由编码4种黑色素瘤相关抗原[纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）、酪氨酸酶、黑色素瘤抗原A3（MAGE A3）和跨膜同源性磷酸酶-张力蛋白（TPTE）]的mRNA构成。4种TAA的mRNA序列均经过优化，可在未成熟的DC细胞中翻译出对应蛋白。每个序列还包含一段信号肽、破伤风类毒素CD4+P2和P6表位以及用于增强人类白细胞抗原( HLA )的抗原提呈和免疫原性功能的主要组织相容性复合体( MHC )Ⅰ转运结构域。
脾脏18-氟-2-脱氧-D-葡萄糖正电子放射断层造影术（PET）结果显示，脾脏代谢功能增强，表明淋巴组织激活。酶联免疫斑点分析结果表明，50例受试者中约75%对4种TAA中的至少1种IFN-γ有阳性结果，即产生免疫反应。抗原特异性T细胞为OD1+CCR7−DD27+/−D45RA−效应记忆性T细胞表型，激活后可分泌IFN-γ和肿瘤坏死因子。在持续接种疫苗的患者中，TTA特异性细胞数量保持稳定甚至增加；而不再继续接种疫苗的患者中，T细胞可存活数月，后续逐渐下降。通过将从接种疫苗的患者处克隆的TAA特异性T细胞受体转染至健康供体CD8+T细胞中，转染后的细胞可以裂解黑色素瘤细胞系。
每次给药后，患者体内IFN-α、IFN-γ、IL-6和其他细胞因子水平提高，通常在接种后数小时达到峰值，24小时后恢复至正常水平，而这与观察到的不良反应事件发生特征一致。不良反应主要是轻度至中度的流感样症状，通常持续时间短暂且具有自限性（自限性疾病是指在疾病发生发展到一定程度后可以自动停止，并逐渐恢复痊愈的疾病，如水痘、玫瑰糠疹、斑秃和普通感冒等）。42例患者的影像学首次评估结果令人振奋。在25例接受单一疗法的受试者中，3例部分缓解，7例疾病稳定；而17例接受疫苗与PD-1联合疗法的患者中，6例部分缓解。有趣的是，2例曾接受抗PD-1治疗后疾病进展的患者，在接种疫苗后重新对PD-1疗法有响应，这一结果支持诱导T细胞属于PD1+效应记忆性T细胞表型的结论。目前，BNT111正在进行黑色素瘤的临床II期试验。
2.个性化新抗原
在肿瘤的发生发展过程中，恶性肿瘤细胞不断突变，产生正常细胞不表达的蛋白序列。这些蛋白质通过蛋白酶体加工成肽段，被T细胞识别。这些新抗原通常是每个患者独有的，为肿瘤特异性、患者定制的免疫疗法带来了机遇与挑战。
在设计编码患者特异性新抗原的mRNA疫苗时，需要采集患者的肿瘤样本，经过下一代测序技术鉴定患者特异的新抗原。编码这种新抗原的mRNA随即输注到该患者体内，以诱导免疫系统攻击肿瘤。然而，这一过程必须加快进度，要在肿瘤进一步进展之前对患者进行有效的治疗。据报道，上述步骤必须控制在30-40天。由于mRNA疫苗生产必须在GMP条件下进行，产品必须通过一定的质量标准，这种要求为药企带来了较大的挑战性。
迄今为止，个性化新抗原疫苗大部分工作仍集中于新抗原多肽疫苗，目前上述工作还未获得实质性成功。理论上讲，肿瘤突变负荷（TMB）最高的恶性肿瘤是新抗原疫苗的最佳应用场景，但也最有可能产生耐药性。与多肽疫苗相比，mRNA编码的新抗原免疫刺激性适中，可以提供更强的免疫原性，患者可获得更多临床获益。与多肽疫苗不同，mRNA可以编码整个抗原，呈现多个抗原表位。此外，mRNA疫苗可同时表达多个新抗原（多个mRNA分别表达不同的新抗原；或将不同的新抗原融合到同一mRNA序列中）。某些肿瘤可以产生几十种新抗原。基于诱导更广泛免疫反应的要求，表达多个表位更可能引发T细胞反应。
BioNTech已经开发了几种用于治疗肿瘤的新抗原候选疫苗。例如，BNT121已经在13例转移性黑色素瘤患者的腹股沟淋巴结中重复给药，临床结果令人鼓舞，该疫苗在患者体内诱发了强大的免疫反应。
BNT122（RO7198457）可编码多达20种个性化新抗原。初步结果表明，该药物单一疗法或与PD-1药物阿替利珠单抗（atezolizumab）联合使用都具有可接受的安全性，而不良反应主要是输液相关的反应和（或）细胞因子释放综合征（发热、寒颤等）。目前，BNT122正在进行黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌的II期临床和三阴性乳腺癌的I期临床试验。
蛋白免疫疗法与细胞免疫疗法
mRNA的一个新兴领域是体内编码可用于治疗的免疫蛋白或免疫调节蛋白，如抗体与细胞因子。与传染病疫苗、肿瘤疫苗相比，这些疗法需要产生更多的蛋白才可发挥作用，某些疾病甚至需要终身服药。
蛋白免疫疗法的一大挑战是将mRNA递送到所有目标器官和细胞中，实现最佳的治疗效果。例如，某些蛋白需要进一步PTM（如糖基化与蛋白水解）才能充分发挥功能。而PTM对蛋白的修饰作用可能是组织依赖性的，而不仅仅取决于mRNA的序列，这进一步说明mRNA需要特异性递送至目标组织。
当mRNA以LNP为载体全身给药时，由于载脂蛋白E可结合至LNP表面，LNP复合物将倾向于分布到肝脏组织，肝细胞表面受体将诱导LNP颗粒的肝细胞摄取。通过调整LNP中脂质成分（包括调整脂质比例和组成）可实现非肝脏的特异性组织分布，如肺组织内皮细胞或脾脏的靶向递送。最近，通过调节PEG-脂质结构，改变LNP表面性质，实现了LNP特异性靶向造血干细胞生态龛中的骨髓内皮细胞。
因此，与疫苗相比，mRNA蛋白免疫疗法在制剂递送、蛋白生产有效性和耐受性方面提出了新的挑战。这也可能是mRNA治疗药物比mRNA疫苗开发进度慢的原因。
1.mRNA编码单抗疗法
直接将mRNA递送至特定组织或器官是mRNA药物开发的屏障。只要药物是安全的，同时合理设计给药剂量控制蛋白表达水平，mRNA药物全身给药是一种合适的给药途径。mRNA-1944是一种编码单克隆抗体（mAb）的mRNA药物。这种药物以LNP为载体，编码一种识别基孔肯雅病毒（Chikungunya virus）的mAb。首项基于健康受试者的临床试验数据表明，所有试验剂量（0.1，0.3，0.6 mg/kg）中都可以检测到中和抗体。但在最高剂量组下，4例受试者中3例出现输注相关反应，其中1例受试者出现3级心动过速、白细胞计数升高、2级恶心、呕吐、发热，同时心电图上存在短暂倒置T波。而经类固醇预处理的同一剂量组别下的另一组受试者没有出现3级不良反应，但基孔肯雅病毒特异性抗体水平（Emax）降低了1.7倍。
以mRNA产生抗体吸引了很多关注，目前业内有多项该领域的合作正在进行。例如，CureVac正和Cenmab合作开展一项基于mRNA的mAb抗肿瘤疗法；Neurimmune和Ethirs合作开展了吸入式mRNA药物，编码抗新冠mAb。这里需要重点考虑的因素是，为什么采用mRNA体内编码抗体，而不是利用传统的重组生产工艺？最有潜力的方法需要综合考虑给药剂量、持续时间、PTM类型、递送系统和目标抗体的安全性等因素。
2.mRNA编码免疫刺激蛋白
另一种抗肿瘤的方法是注射可编码具有直接治疗效果蛋白的mRNA，编码蛋白通过刺激免疫系统[如OX40配体（OX40L）或IL]实现肿瘤杀伤作用。例如，mRNA-2416是一种可编码免疫检查点调节分子OX40L的mRNA药物。在一项临床研究中，41例罹患多种恶性肿瘤的受试者瘤内单药给药没有达到《实体瘤疗效评价标准》（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）中规定的部分缓解的标准。目前，申办方计划进行一项与度伐利尤单抗联合给药用于治疗卵巢癌的临床II期拓展性队列研究。
编码多种不同免疫调节剂的mRNA药物ECI-006是TriMix[编码激活DC细胞多种分子（CD40L、CD70和caTLR4）的mRNA]和编码黑色素瘤特异性TAA（酪氨酸、gp100、MAGE A3、MAGEC2和PRAME的mRNA）的组合。这种药物正在切除黑色素瘤的患者中进行临床I期试验。
另一种思路是产生免疫调节融合蛋白。MEDI1191编码含有IL-12α、IL-12β亚基的单链融合蛋白，两条亚基间以一条连接基团结合。这种药物瘤内注射，预期可以提高全身给药对重组IL-12的耐受性。
3.过继免疫细胞疗法中的mRNA
过继性免疫疗法是一种相对较新的治疗方法，这种方法从患者体内采集自身免疫细胞，体外处理后回输到患者体内，达到治疗肿瘤的目的。Tchou等的研究表明，在乳腺癌瘤内注射转染了编码靶向c-Met的嵌合抗原受体（CAR）mRNA的T细胞，耐受性良好，可以在肿瘤组织中诱发免疫反应。
纳米制剂帮助mRNA递送至不同的免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞等，进一步扩大了免疫疗法的应用前景。例如， T细胞靶向递送mRNA技术为体内生成CAR-T细胞创造了可能性，开辟了肿瘤治疗的新方式。
mRNA疗法的优势与改进空间
1、优势
mRNA在基因疗法和蛋白疗法中占据了独特的地位，结合了两种疗法的优势，又规避了二者面临的挑战。例如，在生物反应器中生产多聚体蛋白难度很大，而这一挑战可以通过单个mRNA或多种mRNA编码蛋白不同亚基后，在患者体内自组装解决。
mRNA在一种CMV候选疫苗和多种肿瘤领域的应用证明了这一技术的灵活性。当前形势下，世界正面临着新冠疫情的威胁，新的毒株层出不穷。这些毒株对已获批的新冠疫苗具有不同的敏感性。随着该领域技术的不断优化和完善，未来还有可能开发出针对传染病和肿瘤以外适应症的mRNA药物。
编码蛋白表达的短暂性使mRNA疗法成为需要单个或少数几种蛋白表达条件下的理想方式，如传染病疫苗。给药可重复、剂量可调整、给药间隔可选择的特性让这种技术具有和经典药物治疗一样的灵活性，使其成为一个可适应患者个体需求的选择，减轻患者对这种新技术的疑虑。而从安全性的角度，两项临床试验（mRNA-1273和mRNA-1647）结果表明，第2次接种后产生的不良反应比第一次接种后更加严重，但这不是一个普遍现象。一些患者接种了超过8次BNT111疫苗，没有观察到严重的不良反应。吸入性mRNA药物MRT5005每周最多服用5次，在此期间没有观察到安全性恶化的趋势。
通过对重组蛋白的研究，mRNA疗法的潜力将进一步扩大。例如，mRNA可编码Fc结构域与治疗结构域的融合蛋白，可有效延长蛋白质的体内半衰期。而更令人兴奋的是将mRNA用于细胞疗法。mRNA基因编辑的瞬时作用可以避免永久表达带来的不良反应。此外，细胞内表达抗体、抗体片段或其他蛋白结合基序可在特定的细胞器（如细胞核）表达，以充分发挥编码蛋白的功效。
mRNA目前还只是作用于免疫系统，应用场景包括传染病疫苗与肿瘤疫苗。新冠mRNA疫苗的获批上市为mRNA技术的可行性验证提供了前所未有的机会，而目前肿瘤疫苗还没有新药获批上市。BNT111的结果表明，将充足的蛋白表达与免疫激活通路相结合可以解决早前蛋白疫苗遇到的一些困难。
2、改进空间
由于RNA可以通过TLR和RIG-1信号通路激活免疫系统，RNA的免疫刺激性对mRNA药物具有非常重要的意义。例如，CV8102没有编码能力，而是作用免疫佐剂。这种免疫刺激性的缺点在于可能引发某些mRNA药物的安全性与耐受性问题。越来越多的证据表明，mRNA药物最常见的副作用是某些炎症反应。例如，在肌内注射或皮下注射时会出现疼痛、红肿、酸胀的局部反应；在肌内注射或吸入药物时可能出现发热综合征或流感样反应。这些症状都可以用抗炎药处理。在静脉注射编码基孔肯雅病毒mAb的mRNA的临床试验中，接受最高剂量的受试者中预先采用类固醇处理可以降低不良反应的发生率，但是这种处理方法降低了编码蛋白的表达水平。
这些数据为未来进一步研究mRNA重复给药的发展方向提供了一些线索。例如，类固醇对缓解mRNA诱发的炎症反应是否有效和必需？如果答案是肯定的，这是否意味着要以牺牲编码蛋白的表达水平为代价？而副作用减少和编码蛋白水平降低是否意味着一定程度的炎症反应实际上是充分的编码蛋白表达的先决条件？如果上述问题的答案都是肯定的，那么临床实践中必须平衡炎症反应程度与编码蛋白表达水平，不能产生阻碍重复给药的不良反应。
回答这些问题并不简单，因为大多数mRNA药物并不是直接注射裸mRNA，而是将其包裹在LNP或PNP中，提高制剂的耐受性。后续的临床试验中，对照组中采用不含mRNA的空白LNP有助于回答mRNA和LNP对制剂耐受性的作用。但是这种对照也有一个缺陷，即空LNP不与带负电荷的mRNA结合时，其物理化学性质与装载有mRNA的LNP制剂不同，不能称为一个严格的对照组。
尽管在单次疫苗接种和用于治疗肿瘤等危及生命的应用场景下，短暂的炎症反应是可以接受的，但对于需要长期治疗的适应症，尤其是通过静脉注射的给药方式，选择具有良好耐受性和安全性的脂质和其他辅料至关重要。动物实验数据在这方面的价值有限，因为报道指出，BNT111在人类中触发的细胞因子浓度比在小鼠体内低1000倍以上；而MRT5005的动物实验中未观察到人体试验中发生的发热反应。
除即刻耐受性外，脂质蓄积带来的长期问题也需要考虑。若mRNA编码的蛋白质半衰期较短，则需要缩短给药间隔以维持临床疗效所必须的蛋白表达量，这可能引发脂质在靶组织和非靶组织中的蓄积，带来健康风险。mRNA的处方工艺将与mRNA生物学一道成为未来研发的重点。
mRNA的给药途径也很有想象空间，如肌内给药、皮内给药、皮下给药、淋巴结注射、瘤内注射、静脉注射和吸入给药等。经过进一步发展，未来有望实现鼻内疫苗、滴眼液或滴鼻液、皮肤药膏、肛门栓剂、膀胱灌注溶液、鞘内输注或Ommaya囊等。未来mRNA的治疗领域将直接取决于纳米药物递送技术的进步。越来越多的证据表明，LNP和PNP可以实现机体组织靶向（如肝脏、内皮、肺、骨骼以及免疫系统的多个组织）。而通过对递送材料的改进以及其他功能性材料的修饰，提高递送系统的靶向性与递送能力，mRNA的应用场景将进一步拓宽。
目前，两款经EUA获批的新冠疫苗凸显了mRNA的一大优势，即临床试验药物的快速生产能力。最初为个体化新抗原疫苗开发的制备工艺使得新冠病毒序列公布后的数周，候选mRNA疫苗临床试验随即展开，充分证明了其快速响应能力。
然而，新冠疫苗的使用也凸显了这项技术的另一个问题：对冷链贮存与运输的依赖。mRNA需要在-80℃贮存与运输，不是所有药房和临床试验基地都具备这样的条件；对于患者在家中自行给药，-20℃的保存条件都可能难以满足。因此，提高mRNA药物的稳定性将是其处方工艺研究的下一个重点。
小结
总结来说，在新冠疫苗的竞赛中，mRNA作为一种安全、有效的技术平台，加速了全球对于mRNA-LNP系统风险/获益的认知。目前，公众对于BNT162b2和mRNA-1273的生产能力、储存条件以及两种疫苗的副作用更加关注；而学界更加关注这两种疫苗之外的问题，迫切地希望mRNA能够在其他适应症中得以验证。
