HCV非结构型蛋白5B (NS5B)是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，它是HCV ＲＮＡ 复制的关键酶。我们之前的研究表明RdRp是由蛋白激酶Ｃ－相关激酶２(PRK2)磷酸化的。在此项研究中，我们用生物化学和反求遗传学方法阐明了ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ磷酸化对细胞培养中病毒RNA复制非常重要。二维磷酸氨基酸分析揭示了PRK2可在体内或体外专一地磷酸化NS5B的丝氨酸残基。用体外激酶实验和质谱，在与NS5B拇指亚结构域相互作用的Δ1指环区，我们发现两个磷酸化位点，Ser29 和Ser42。 药物选择性HCV亚基因RNA复制子的集落形成实验揭示了以Ala替代Ser29或 Ser42妨碍其磷酸化使得HCV RNA复制受损。进而，通过编码磷酸化缺陷NS5B的HCV感染性克隆进行的反求遗传学研究证实了这些病毒RNA复制总的PRK2磷酸化位点的重要功能。分子模型研究预测NS5B的磷酸化使得它的Δ1环和拇指亚结构域之间的相互作用更为稳定，这是NS5B 的闭合结构的形成是必须的，并对RNA的从头合成至关重要。综上所述，我们的研究显示HCV NS5B磷酸化对HCV RNA复制具有正向调节作用。
重要性:
RNA 依赖的RNA聚合酶(RdRps)在病毒RNA复制中的作用已经非常明确，但磷酸化对其调节功能仍认识不多。在这项研究中，我们阐述了一些重要问题，均与HCV非结构蛋白5B（NS5B）磷酸化后的功能和结构相关。以编码磷酸化缺陷的NS5B突变体的HCV复制子进行反求遗传学研究，对它们的RdRps活性的分析显示之前未知的与HCV复制和NS5B磷酸化相关的NS5B蛋白特征。这些反应了NS5B的Δ1指环结构域与两个识别磷酸化位点Ser29 和 Ser42的磷酸化诱导了潜在的结构改变，并能短暂的影响NS5B的闭合结构。阐明在病毒复制中NS5B磷酸化状态的动力学改变的影响和它们对RNA合成的影响将改善我们对NS5B磷酸化介导调节HCV复制的分子机制的理解。
