单分子显微镜极大地扩展了我们对细胞环境中蛋白质复合物的结构组织、功能构象和动力学的理解。单分子成像方法在提高空间分辨率、穿透深度和活细胞成像能力方面取得了显著进展。具有高空间分辨率的单分子成像方法都采用了轴向聚焦锁定（如全内反射模式下的红外激光器）和横向校正方法（如荧光标记物）的组合。即使在分析后处理，不准确或缓慢的主动校正也会导致漂移降低定位精度和降低原位分辨率。
通过结合光学捕获和优化单个发射体的x/y位置和宽度(z)，可将纳米精度的实时聚焦锁应用于离体样品。然而，当在>5μm的深度成像时，这些方法都没有被证明能显著改善商用的轴向聚焦锁，这些轴向聚焦锁通常具有~20nm的精度（即尼康完美聚焦），并且提供有限的横向补偿。因此，尽管荧光成像技术能够具有较高的定位精度和较高的穿透深度，但它们对3D成像的一般适应性仍然有限。因此，一种具有活细胞兼容性、跨微米范围的绝对三维定位和比以前报道过的任何单分子方法的光子限制定位精度更好的聚焦方法是非常可取的。
近日，澳大利亚新南威尔士大学医学院的Simao Coelho等人通过使用双光子激光直写来控制样品的三维结构和基准的位置来解决这些聚焦限制。在此过程中，作者可以重复地实现跨细胞体积的所有维度的实时亚纳米聚焦。通过获得三维单分子获取和具有纳米精度的活细胞单粒子跟踪，证明了该方法的多功能性。相关工作发表在《NATURE COMMUNICATIONS》上。
