• 快讯 Cell Rep: 抗病毒药物筛选揭示DNA损伤修复抑制剂的抵抗SARS-CoV-2感染的能力

    来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    编译者:hujm
    发布时间:2021-04-12
    SARS-CoV-2传播引发的COVID-19疫情已经成为全球性的公共健康危机,因此,寻找能够抑制病毒感染能力的药物也成为了亟待解决的问题。在最近发表在《Cell Reports》杂志上的研究中,来自美国加州洛杉矶分校的Vaithilingaraja Arumugaswami团队通过高通量的药物筛选系统,从430中蛋白质激酶抑制剂中筛选得到了34个候选物,这些分子能够有效抑制SARS-CoV-2在人上皮细胞中的传播。 在该研究中,作者首先建立了SARS-CoV-2感染性细胞培养系统和基于Vero E6细胞的病毒学检测方法。 SARS-CoV-2分离株USA-WA1 / 2020来自于美国NIAID。SARS-CoV-2在Vero E6细胞中传代,之后将病毒储备液保存在-80°C。通过中值组织培养物感染剂量(TCID50)方法,作者检测了Vero E6细胞中的病毒滴度。 在感染SARS-CoV-2的细胞中,作者观察到了明显的细胞病变效应(CPE),表明病毒复制和相关的细胞损伤的发生。感染后48小时(hpi),作者使用SARS-CoV-2刺突蛋白(S)抗体免疫荧光分析(IFA)手段检测了病毒感染的程度。作为一项验证性实验,作者还证明了已知的抑制剂羟氯喹(HQ),IFN-β,IFN-α和EIDD-2801(molnupiravir)等均能够有效阻断SARS-CoV-2的感染。基于上述结果,作者将该平台用于后续的药物筛选研究。 为了评估细胞蛋白激酶抑制剂的抗病毒特性,作者选择了一个药物库来进行中等通量的初级药物筛选,该化合物库广泛覆盖了430种激酶抑制剂,且筛选化合物具有很强的抗病毒活性且低毒性水平。该库中涵盖518种人类蛋白激酶,其中478种激酶属于通一个超家族。由于药用局限性,作者筛选了正在临床研究中接受测试的激酶抑制剂,从而获得了430种化合物。 之后,作者将不同药物分子配制成DMSO溶液,并以2x浓度(最终药物浓度,250 nM)铺入培养基中,进而将含有化合物的培养基添加到Vero E6细胞中,然后以0.1的感染复数(MOI)加入SARS-CoV-2。在37°C,5%CO2下孵育48小时后,作者对病毒CPE进行成像分析并且进行了信号通路分析。实验结果结合数据库分析结果显示,候选化合物影响了包括 mTOR,AKT,PI3K,SRC,ABL和ATR等在内的信号途径,例如mTOR-PI3K-AKT,ABL-BCR / MAPK和DNA损伤反应(DDR),表明这些抗病毒药物的特殊性质。 作者根据候选物的抗SARS-CoV-2活性快速确定最有前途的化合物并对其进行优先级排序,第一次筛选得到了34种化合物。在Vero E6细胞中,化合物berzosertib(M6620),torin2和vistusertib(AZD2014)在半最大抑制浓度(IC50)均低于25 nM时表现出明显的抗病毒活性,而尼罗替尼,NVP-BHG712,VPS34-INI,URMC-099和YM201636的IC50范围在50到125 nM之间。核苷类似物,如瑞姆昔韦,EIDD-2801(molnupiravir)和利巴韦林等可抑制病毒RdRp酶,并且还可能在病毒基因组复制过程中引发编辑错误。二次筛选证实了这些激酶抑制剂的抗病毒活性以及在病毒感染后被激活。此外,作者发现几种抗病毒化合物能够靶向mTOR-PI3K-AKT途径,包括dactolisib,AZD2014和torin2。 此外,作者发现Berzosertib在多种细胞类型中均表现出针对SARS-CoV-2的有效抗病毒活性,其作用机制是其能够在病毒进入细胞后阻止复制过程。 Berzosertib也抑制SARS-CoV-1和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的复制。综上,作者的研究强调了使用有前途的激酶抑制剂,以限制SARS-CoV-2的复制作为宿主导向的治疗方法,并提供了宿主-病原体相互作用的重要机制。
  • 快讯 Cell Rep: 新型免疫策略有助于诱导HIV-1膜蛋白三聚体广谱性中和抗体的产生

    来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    编译者:hujm
    发布时间:2021-04-12
    长期以来,可溶性“ SOSIP”稳定化的包膜(Env)三聚体被认为是有前途的HIV疫苗免疫原。但是,它们会诱导针对无糖化的三聚体基底部结构域的高滴度反应,而在天然病毒中该表位往往是被“掩盖”的。为了描述针对融合肽(Fusion Peptide,FP)位点的免疫原引发的靶向基地结构域的免疫反应,来自美国NIH 的John R. Mascola团队定量研究了各种SOSIP稳定化的Env三聚体和FP载体免疫策略在诱导非人类灵长类动物产生针对Env三聚体基底结构域抗体的特征。 研究结果显示:靶向三聚体基底结构域的抗体反应在仅使用三聚体膜蛋白免疫的动物中约占90%,在用SOSIP三聚体和FP结合物联合免疫的动物中约70%,在FP初免-三聚体增强的策略免疫的动物中中约30%。值得注意的是,FP引发的动物的广谱中和抗体的产生水平与靶向三聚体基底结构域的抗体产生水平呈负相关。这些结果提供了量化分析抗体反应发生率的方法,并揭示了FP接种可以减少三聚体碱基反应并改善中和结果。 首先,作者选择了49只灵长类动物(NHP)进行研究,它们被分为8组,分别接受了3种不同类型的免疫原接种:1)三聚体,2)三聚体-FP,3)FP初免(prime)+三聚体增强(boost)。第一组三包括总共23只动物,它们在第0周和第4周接受三聚体免疫,并在第6周采集血浆样品进行分析。第一组的免疫原包括BG505 DS-SOSIP或CH505 DS-SOSIP脱聚糖变体,其中 a) . 在融合肽周围去除了三个聚糖(N230,N241和N611); b) . 四个聚糖(N88,N230,N241和N611)在融合肽附近去除; 或者 c) . 在CD4结合位点(CD4bs)附近去除了三个聚糖(N197,N276和N462)(天然CH505三聚体在CD4bs附近的N362缺失了聚糖)。 CH505 DS-SOSIP免疫原进一步被构建为嵌合体,其中gp120的N和C末端以及整个gp41亚基的部分被BG505的序列取代。结果显示,CH505和BG505免疫原接种后产生的针对基底结构域的抗体反应是相同。值得注意的是,此前研究仅对三聚体中的FP特异性反应的分析,但尚未发现针对基底结构域的特异性反应。 进一步,作者检测了针对Env三聚体基底结构域的特异性血浆抗体反应。研究结果显示,针对基底结构域的Fab能够阻断单克隆抗体或血浆抗体对基底结构域的识别,但不会影响广谱性中和型抗体(bNAb)对三聚体主要侵染位点的识别。 之后,作者发现在给受试动物接种FP(仅接种FP或与DS-SOSIP联合),均能够显著降低针对基底结构域的抗体的产生水平。此外,针对基底结构域的抗体反应程度以及广谱中和抗体的产生水平之间存在明显的负相关性。 综上,该研究揭示了不同的免疫策略对靶向基底结构域抗体产生水平的影响以及其对广谱中和抗体产生水平的影响,对于进一步开发针对HIV-1的广谱性中和抗体疫苗具有积极的意义。
  • 快讯 Cell Rep: 非中和alpha病毒抗体保护机制

    来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    编译者:hujm
    发布时间:2021-04-12
    尽管针对α病毒E2蛋白抗原决定簇的中和单克隆抗体(mAb)可以起到防止病毒感染的效果,但人们对非中和mAb的功能仍知之甚少。在最近发表于《Cell Reports》杂志上的一项研究中,来自华盛顿大学圣路易斯分校的Michael S. Diamond团队评估了13种非中和性单克隆抗体针对Mayaro病毒(MAYV)(一种新兴的致关节炎性alpha病毒)的活性。 首先,作者希望分离针对MAYV的非中和性单克隆抗体,对此,他们对小鼠进行了MAYV感染,并且随后接种了MAYV E2(1-340)蛋白以增强感染效果。之后,研究者们建立了杂交瘤培养体系并从中分离了144株单克隆抗体,Elisa检测显示其具有结合E2蛋白的能力。为了寻找广谱性抗体,作者向Vero-E6细胞感染了另外一株病毒BeH407,其与原始MAYV的E2-E1氨基酸序列存在96%的相似性。流式筛选最终得到了73株符合条件的单克隆。由于此前研究表明IgG2c具有较强的抗病毒活性,因此作则从中挑选除了13株IgG2c单克隆。 中和试验结果显示,上述13株克隆相比此前鉴定出的中和性抗体MAY-117,均没有任何中和活性。然而,这些抗体与病毒E2蛋白的结合能力却依然存在。在此基础上,作者希望了解上述抗体与病毒蛋白结合的具体表位信息。通过高通量突变筛选,作者发现了六个结合基团,这些结合基团位于E2糖蛋白的A结构域内或附近的离散表位。由于它们能够与变性后的抗原表位结合,表明其可能主要识别抗原的线性表位。 最后,作者研究了上述抗体的体内生理学意义。结果显示,非中和性抗体的被动输入可预防小鼠的MAYV感染和疾病的发生,而其功效的实现依赖下游Fc介导的效应,即Fc介导的单核细胞在体内参与了非中和性单克隆抗体的保护作用。此外,作者发现表达Fcγ受体的髓样细胞可促进MAYV的结合,吸收和清除,而不会引起抗体依赖性感染的增强。综上,上述结果为提供保护alpha病毒感染的新型抗体治疗策略提供了新的思路。
  • 快讯 Cell Research:科学家发现新冠病毒多抗体鸡尾酒协同作用的结构基础

    来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    编译者:hujm
    发布时间:2021-04-12
    严重的急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的正在进行中的2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行导致了前所未有的公共卫生危机,促使全球努力快速开发出有效的针对COVID-的新治疗策略人单克隆抗体(mAbs)是有前途的治疗分子,可用于预防或治疗病毒感染性疾病,包括COVID-19。 基于此,为进一步揭示三抗体及四抗体鸡尾酒协同效应的分子基础,中科院生物物理所王祥喜研究员、四川大学华西医院李为民教授、浙江省疾病预防控制中心张严峻研究员合作在《Cell Research》上发表文章 “Structure-based development of three- and four-antibody cocktails against SARS-CoV-2 via multiple mechanisms ”,分别对SARS-CoV-2 S三聚体与两组多抗体鸡尾酒(FC05-H014-P17;FC05-H014-P17-HB27)复合物的冷冻电镜结构进行解析。 为了探索配制包含三个或四个NAb的混合物的可能性并测试其对SARS-CoV-2的有效性,该研究团队首先研究了通过竞争性表面等离子体激元共振(SPR)将三个靶向RBD的NAb与S三聚体同时结合的方法。 。标记为SARS-CoV-2 S三聚体的CM5传感器被一种抗体完全饱和,并在流通物中被另外两种抗体淹没。发现HB27完全饱和,从而阻止了P17与SARS-CoV-2 S三聚体的结合,反之亦然。有趣的是,HB27的完全占用阻止了H014与SARS-CoV-2 S三聚体的结合,而在H014过多的情况下HB27仍可以附着于S三聚体,这与H014与S三聚体的0–3结合的结构观察相符。相反,已证明H014和P17同时与SARS-CoV-2 S三聚体结合。不出所料,靶向NTD的FC05的结合不会影响三个RBD特异性NAb中的任何一个与SARS-CoV-2 S三聚体之间的相互作用。毫不奇怪,竞争性结合测定法验证了由同时靶向三个不同区域的FC05,H014和P17组成的合理的三抗体混合物 接下来,在三抗体混合物的冷冻-EM结构中,总共有九个拷贝的Fab结合到一个S三聚体上,其中三个FC05 Fab结合在每个NTD的侧面,而三个H014和三个P17 Fab结合在一个NTD的侧面。每个RBD的顶部和顶部分别屏蔽了完整的S1,从而完全阻断了与受体和细胞表面蛋白酶的任何可能接触。有趣的是,九个拷贝的Fab分子紧密排列在S三聚体的三角形外部,紧密连接所有三个S1亚基并抑制其构象转变,这是病毒膜融合的前提。在H014绑定时,所有三个RBD都以开放配置站立,为S2顶部的三角形内部留出了空间。 最后,在B.1.1.7和501Y.V2中HB27的表位上已经出现了一个点突变。尽管如此,SARS-CoV-2的S三聚体及其两个变体显示出与HB27相当的结合能力。如预期的那样,由于B.1.1.7中的RBD突变均不位于P17表位之内,因此P17与SARS-CoV-2一样有效地与变异B.1.1.7结合。然而,由于在表位中出现点突变E484K,该抗体与变体501Y.V2的结合大大降低。同样,B.1.1.7和501Y.V2中FC05表位的残基141缺失和新R246I突变的存在,极大地降低了FC05对这两个变异体的结合亲和力。这些结果表明在鸡尾酒中结合不同抗体的中和活性以对抗当前变种所构成的免疫逃逸威胁是有用的,强调了多种基于NAb的鸡尾酒作为抗SARS-CoV-2感染的治疗剂的突出优势。 综上所述,这项工作剖析了在鸡尾酒中混合在一起时展现出对S三聚体的三个或四个表位具有不同特异性的抗体之间所观察到的协作相互作用的性质,并揭示了抗体与S三聚体协同结合的分子基础,具有协同作用。通过多种机制进行中和和保护。此处揭示的抗体-抗原相互作用的原理也可能有助于合理设计针对其他病毒的治疗性鸡尾酒。
  • 快讯 Cell: 新型CRISPR转录组学编辑“机器”有助于重塑转录组记忆

    来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    编译者:hujm
    发布时间:2021-04-12
    基因编辑技术的进步大幅提升了我们修饰人类基因组的能力。基于sgRNA介导的CRISPR- Cas9相关基因编辑技术能够在指定位点引入DNA断裂以失活基因功能或通过同源性DNA修复引导精确的DNA编辑,这些技术已针对基础DNA序列的靶向变化进行了优化,因此非常适合修复或引入致病性突变。然而,上述技术对内源性DNA修复机制的依赖提出了挑战,因为这些途径的复杂性可能使其难以进一步提升精确性。 调节基因功能的另一种方式是在表观遗传学水平进行影响,从而控制基因表达而无需改变基础的DNA序列。此前研究已经表明,失去催化活性的dCas9可以增强(CRISPRa)或抑制(CRISPRi)哺乳动物细胞中的基因转录水平。可编程的表观基因组编辑是可调的,可逆的,并且不需要DNA断裂,有效地绕过了与基因编辑相关的细胞毒性。但是,当前的可编程表观基因组编辑技术通常依赖于dCas9融合蛋白的组成型表达来维持转录控制。因此,这些方式仍然不太适合细胞治疗和生物工程的应用。 最近的工作表明,表观基因组编辑有可能编写一种稳定的转录程序,该程序可以被人类细胞记住并传播,而无需可编程表观遗传调节剂的组成型表达。 此外,可以通过募集DNA甲基转移酶和KRAB结构域的混合物来沉默基因。然而,迄今为止,表观遗传记忆编写程序仅对少数内源性人类基因进行了沉默测试。此外,以前的可编程表观遗传沉默子设计为每个靶基因使用两个或三个融合蛋白,这在实验操作上很麻烦(尤其是对于多重基因靶向),从而使得基因靶向策略更加复杂。此外,基于TALE的KRAB与DNMT3A和DNMT3L结构域的融合导致基因沉默效率的长期低下。目前尚不清楚这些方法对于建立具有“遗传性”的基因沉默技术的通用性以及是否存在编写和维持可遗传表观遗传沉默程序所需的基因组特征。对此,一个合理的假设是:由单个失活Cas9融合蛋白组成的表观遗传编辑元件将有助于广泛地探索“可遗传”表观遗传基因沉默技术的实用性。 在最近发表在《Cell》杂志上的一项研究中,来自UCSF的Jonathan S. Weissman团队介绍了一种名为“CRISPRoff”的技术,包括其设计理念,开发过程和技术验证,CRISPRoff是一种可编程的表观遗传记忆编写器蛋白,可以持久抑制基因表达。 研究发现,CRISPRoff的瞬时表达编写了一种表观遗传程序,从而维持人类细胞450多次的细胞分裂,突显出这种形式的基因沉默是稳定且可遗传的。 CRISPRoff表观遗传记忆可以使用称为CRISPRon的多部分表观遗传编辑器进行逆转,该编辑器可特异性删除DNA的甲基化修饰并募集转录元件。 使用全基因组CRISPRoff筛选,作者证明了这种方法可以持久且特异性地沉默绝大多数蛋白质编码基因,并且具有广泛的靶向性。此外,对于CRISPRoff介导的稳定基因沉默而言,规范的CpG岛标签不是必需的。 最后,作者证明了CRISPRoff可用于在人类干细胞中介导沉默增强和工程化的基因沉默程序,这些程序在神经元的不断分化过程中持续存在。总而言之,该系统使研究者们能够广泛探索表观遗传沉默的生物学规则,并提供了一个强大的工具来控制基因表达,靶向增强子以及探索表观遗传的原理。