《Cell: 新型CRISPR转录组学编辑“机器”有助于重塑转录组记忆》

  • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者: hujm
  • 发布时间:2021-04-12
  • 基因编辑技术的进步大幅提升了我们修饰人类基因组的能力。基于sgRNA介导的CRISPR- Cas9相关基因编辑技术能够在指定位点引入DNA断裂以失活基因功能或通过同源性DNA修复引导精确的DNA编辑,这些技术已针对基础DNA序列的靶向变化进行了优化,因此非常适合修复或引入致病性突变。然而,上述技术对内源性DNA修复机制的依赖提出了挑战,因为这些途径的复杂性可能使其难以进一步提升精确性。

    调节基因功能的另一种方式是在表观遗传学水平进行影响,从而控制基因表达而无需改变基础的DNA序列。此前研究已经表明,失去催化活性的dCas9可以增强(CRISPRa)或抑制(CRISPRi)哺乳动物细胞中的基因转录水平。可编程的表观基因组编辑是可调的,可逆的,并且不需要DNA断裂,有效地绕过了与基因编辑相关的细胞毒性。但是,当前的可编程表观基因组编辑技术通常依赖于dCas9融合蛋白的组成型表达来维持转录控制。因此,这些方式仍然不太适合细胞治疗和生物工程的应用。

    最近的工作表明,表观基因组编辑有可能编写一种稳定的转录程序,该程序可以被人类细胞记住并传播,而无需可编程表观遗传调节剂的组成型表达。 此外,可以通过募集DNA甲基转移酶和KRAB结构域的混合物来沉默基因。然而,迄今为止,表观遗传记忆编写程序仅对少数内源性人类基因进行了沉默测试。此外,以前的可编程表观遗传沉默子设计为每个靶基因使用两个或三个融合蛋白,这在实验操作上很麻烦(尤其是对于多重基因靶向),从而使得基因靶向策略更加复杂。此外,基于TALE的KRAB与DNMT3A和DNMT3L结构域的融合导致基因沉默效率的长期低下。目前尚不清楚这些方法对于建立具有“遗传性”的基因沉默技术的通用性以及是否存在编写和维持可遗传表观遗传沉默程序所需的基因组特征。对此,一个合理的假设是:由单个失活Cas9融合蛋白组成的表观遗传编辑元件将有助于广泛地探索“可遗传”表观遗传基因沉默技术的实用性。

    在最近发表在《Cell》杂志上的一项研究中,来自UCSF的Jonathan S. Weissman团队介绍了一种名为“CRISPRoff”的技术,包括其设计理念,开发过程和技术验证,CRISPRoff是一种可编程的表观遗传记忆编写器蛋白,可以持久抑制基因表达。

    研究发现,CRISPRoff的瞬时表达编写了一种表观遗传程序,从而维持人类细胞450多次的细胞分裂,突显出这种形式的基因沉默是稳定且可遗传的。 CRISPRoff表观遗传记忆可以使用称为CRISPRon的多部分表观遗传编辑器进行逆转,该编辑器可特异性删除DNA的甲基化修饰并募集转录元件。

    使用全基因组CRISPRoff筛选,作者证明了这种方法可以持久且特异性地沉默绝大多数蛋白质编码基因,并且具有广泛的靶向性。此外,对于CRISPRoff介导的稳定基因沉默而言,规范的CpG岛标签不是必需的。

    最后,作者证明了CRISPRoff可用于在人类干细胞中介导沉默增强和工程化的基因沉默程序,这些程序在神经元的不断分化过程中持续存在。总而言之,该系统使研究者们能够广泛探索表观遗传沉默的生物学规则,并提供了一个强大的工具来控制基因表达,靶向增强子以及探索表观遗传的原理。

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    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2020-01-10
    • 近日,美国斯坦福大学的研究人员在对人类微生物组的大规模分析中,发现了超过四千种过去不为人知的小型蛋白质,如果这些蛋白质的形状和功能可以在实验室中重建,那么它们将有助于研究人员增进对微生物组如何影响人类健康的科学理解,并为新药的开发铺平道路。 该研究已发表在《Cell》上。 我们的身体仿佛一个充满了数万亿细菌的工厂,但这并不像听起来那么可怕。事实上,越来越多的证据表明,我们健康的许多方面都与人体微生物组的组成密切相关,尽管其大部分机制尚未明确。 在这项研究中,研究人员对来自1773个人类个体的四个不同身体部位的相关基因组进行了比较基因组学研究。他们发现,微生物组正在产生几千个蛋白质,这些蛋白质非常小,以至于在过去的研究中未被注意到。它们属于超过4000多个保守的蛋白质家族,其中大多数都是新的的,有超过90%的小蛋白质家族没有已知的结构域,而且几乎一半没有在参考基因组中表达。研究人员估计它们还参与到其他过程中,包括不同种类的细菌在生态位中为争夺资源而进行的斗争,即微生物与其宿主细胞间的通信,以及维持细菌健康和正常的任务。 因为它们非常小,长度不到50个氨基酸,所以它们很可能折叠成独特的形状。一旦其形状和功能在实验室中重建,这将会帮助研究人员增进对微生物组如何影响人类健康的科学理解,并为新药的开发铺平道路。 “一个明显的盲点” 该研究通讯作者、医学和遗传学助理教授Ami Bhatt博士说:“理解人体细胞和微生物组之间的关系是至关重要的。它们如何通信?不同细菌菌株如何保护自己免受其他菌株的侵害?这些功能很可能存在于非常小的蛋白质中,它们可能比较大的蛋白质更容易在细胞外分泌。” Ami Bhatt 但是这些蛋白质太小,以至于传统方法难以鉴定和研究它们。 Bhatt说:“在试图预测哪些细菌DNA序列包含这些基因时,我们很容易犯错。到目前为止,我们已经系统地忽视了它们的存在。这是一个明显的盲点。” 对于不了解情况的人来说,如果对我们每个人身上存在的大量细菌进行过深入的思考,可能会让人感到害怕。这些细菌在人体内外的数量远远超过人体细胞的数量。然而,它们大部分都是无害的。相反,它们帮助我们消化、补充我们的饮食,使我们的身体保持良好状态。但在许多情况下,很难区分这种合作关系背后的分子细节。 Bhatt和同事们猜测,答案可能存在于这些小蛋白质中,而这些蛋白质在其他关于微生物组的研究中都未被关注。他们推测,小型蛋白质比大型蛋白质更有可能通过细胞膜向邻近的宿主或细菌细胞传递信息。 但是如何识别并研究它们呢? Bhatt说:“细菌基因组就像一本由长长的字符串组成的书一样,其中只有一些编码了制造蛋白质所需的信息。在传统方法中,我们通过搜索表示夹在基因中间‘开始’和‘停止’信号的字母组合来识别蛋白质编码基因。这对较大的蛋白质很有效,但蛋白质越小,这种技术产生大量假阳性的可能性就越大,从而混淆了研究结果。” 巨大的惊喜 为了解决这个问题,该研究第一作者博士后研究员Hila Sberro决定比较大量不同微生物和样本中潜在的小蛋白编码基因。她认为,在多物种和样本中被反复鉴定的那些更可能是真实的。当Sberro将这些分析应用于大型数据集时,她发现了数万种基因,而非预期中的几百个。据预测,由这些基因编码的蛋白质可以被分类成超过4000个相关的组或家族,很可能涉及到很多关键的生物学过程,比如细胞间通信和竞争,以及维持细菌健康所必须的要素。 Bhatt说:“坦率地说,我们不知道会发生什么。我们对此结果毫无直觉。但事实上,她发现了成千上万种新蛋白质族,这一事实无疑让我们所有人都感到惊讶。” 研究人员证实,这些基因编码了真正的蛋白质,它们被转录成RNA,然后被转运到核糖体,完成所有蛋白质生成途径的关键步骤。通过这一事实,研究人员证实了这些基因能够编码真正的蛋白质。他们正在与其他团队合作进一步研究这些蛋白质的功能,并确定哪些蛋白质对细菌在复杂肠道环境中争夺空间是重要的。这些蛋白质很可能被用于新抗生素或药物的开发。 Bhatt说:“小型蛋白质可以被快速合成,也可以被细菌用作转换功能状态的生物开关,或者用于触发其他细胞的特定反应。它们还比大型细胞更容易研究和操控,这有利于药物开发。我们预计这将成为生物研究的一个有价值的新领域。”
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    • 来源专题:转基因生物新品种培育
    • 编译者:Zhao
    • 发布时间:2018-01-09
    • 仅仅数年间,使用 CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)/ Cas9 进行基因组编辑在科研上激起了巨浪,该技术使研究人员能够精确而方便地编辑特定的基因。然而,新技术也存在一些缺点,例如在错误的地点切割 DNA,甚至是随机地进行 DNA 编辑。 但是科学家们很快开始将 CRISPR 拉回了正确的轨道,如今创新性的分子特性使它更好地作用并能用于更多类型的细胞。CRISPR 应用的迅速出现意味着艾滋病、癌症、镰状细胞病等其他疾病的临床试验出现了端倪。 今天的 CRISPR 技术对于更多研究者来说也是一个尖端的工具,与其他基因调控方法相比,更适应于未来的医疗应用。“回到 RNA 干扰(RNAi)时代,感觉就像进入了超光速飞船。” 整合 DNA 技术公司的高级副总裁和首席科学官 Mark Behlke 说,该公司提供 RNAi 和 CRISPR 的试剂。“但现在 CRISPR 使它看起来像一个孩子的游戏,实在令人惊讶。” 相比于其他基因编辑方法,如 TALENs(类转录激活因子效应物核酸酶)和锌指核酸酶, CRISPR 更加快捷便宜,也更易于使用,从而快速地被许多领域的科学家所接受。例如,癌症研究人员将包含编码 CRISPR 向导 RNA(guide RNA)和 Cas9 (CRISPR 关联蛋白 9)的质粒 DNA 转入细胞系中,创造出对应不同研究的癌细胞系。 然而斯坦福大学医学院副教授,儿科医生 Matt Porteus 对于 CRISPR 起初有着不同的体验。他说,“每个人都表示 CRISPR 会帮助解决世界上的所有问题,但当我们试图将细胞中的 CRISPR DNA 质粒应用在我们认为重要的治疗中,如造血细胞系或其他原代人类细胞类型,该系统根本不起作用。” 因此,Proteus 实验室研制出的一种在人原代细胞中进行 CRISPR/Cas9 编辑的不同递呈方法, 完全不需要 DNA 质粒。 该方法的变化在于通过核糖核蛋白(RNPs)形式将 CRISPR/Cas9 试剂引入细胞。“研究人员将这些试剂(gRNA 和 Cas9 蛋白)组合起来,给它们 5 到 10 分钟的时间形成复合体,从而合成出 RNPs。” 赛默飞世尔公司合成生物学研发部高级主管 Jon Chesnut 说,“CRISPR RNPs 可通过脂质纳米粒子或电穿孔的方式传递到细胞中。” 虽然 RNP 试剂已被广泛使用,但近些年研究人员对它们的兴趣还停留在 CRISPR 方法的层面。“这是由于早期基于质粒的方法中有大量的 DNA 工具被广泛接受,大家还存在意识的盲区。” Dharmacon 公司(GE 医疗集团的子公司)高级产品经理 Louise Baskin 说。与质粒载体方法相比,无 DNA 的、基于 RNP 的 CRISPR 方法的好处在于没有意外 DNA 的插入,能够降低毒性,对目标效果更好,并且提高了特异性。 这些优点使得无 DNA 的 CRISPR 工具更适合于在治疗中应用。“对我们来说,在原代组织和原代细胞类型中的基因编辑能力是一个巨大的突破。” 加州大学旧金山分校(UCSF)细胞与分子药理学博士后 Judd Hultquist 说。 通过与 Kathrin Schumann(UCSF 医学院微生物学和免疫学博士后)合作,Hultquist 将 Dharmacon 公司 Edit-R 合成 gRNAs 的 RNPs 用在人原发性 T 细胞中,该细胞是艾滋病病毒的主要目标。现在他们正在开发一种基于 RNP 的平台,目标在于寻找能够提高 T 细胞对 HIV 感染抗性的遗传变化。 CRISPR 的核糖核蛋白的使用也彻底变革了模式动物系统(例如秀丽线虫)。对于秀丽线虫而言,CRISPR 是一个真正的游戏改变者。” 华盛顿大学医学研究所副教授 Brian Kraemer 说,他是 IDT 公司的无 DNA CRISPR 试剂的使用者。 将核糖核蛋白注入到线虫性腺区,可以进行生殖细胞的基因组编辑,随后可以分离出具有编辑表型的后代进行后续研究。Kraemer 的实验室利用线虫作为模式去识别蛋白质聚集疾病(如老年痴呆症和肌萎缩性侧索硬化症)的致病机制所需要的基因。 Kraemer 认为,新的 CRISPR 工具将引燃下一代线虫转基因模型,包括定制等位基因,依照实验的目的而改变基因编码蛋白,例如通过改变胞内转运蛋白的靶序列,可以使它定位到一个不同的细胞膜区域。 提高原代细胞(也包括其他细胞)CRISPR 的关键之一,是近期的增强试剂。IDT 公司开发了经过化学修饰的能够在胞内抵抗核酸酶降解的 gRNA。该公司还开发了两个短的 RNA 形式的 gRNAs(就像在原初细菌系统中),能够形成复合体,而不是单一的、更长的 gRNA。MilliporeSigma 公司也计划提供称为 “SygRNAs” 的两部合成 gRNAs。 牛津大学威廉邓恩爵士病理学院的基因组工程平台负责人 Joey Riepsaame,采用 IDT 公司的 Alt-R CRISPR/Cas9 RNP 系统来辅助进行基因编辑实验。Riepsaame 称赞 IDT 公司的两步合成 gRNAs,能够减少诱发不必要的免疫反应。“这对我来说是一个非常重要的因素,因为我的项目涉及到使用 CRISPR/Cas9 纠正免疫细胞中疾病诱发的突变。” 他说,“到目前为止,我们还没有在 CRISPR/Cas9 中遇到任何重大的挑战,并且能够靶向到每个感兴趣的区域。” 优化的 CRISPR 试剂,如 RNPs 也给研究人员提供新的机会。以 DNA 为基础的 CRISPR(甚至 Cas9 的信使 RNA)的一个问题,是在开始编辑前存在一个滞后阶段,这期间细胞机制会转录和 / 或翻译活性 CRISPR 试剂。例如,将基于 DNA 或 mRNA 的 CRISPR 试剂注射进胚胎中时,结果能够产生一种称为 “镶嵌体”,也就是具有超过一种的遗传信息的动物。“RNP 的方法能够降低镶嵌现象,因为它的试剂在引入的同时就被激活,在编辑后快速降解,同时对于降低脱靶效应也有好处。” IDT 公司的 Behlke 说。 其他的新工具,包括用于将 CRISPR 试剂更好的传递到细胞中的转染试剂。MTI-GlobalStem 公司新的 EditPro 干细胞转染试剂能够将 CRISPR 工具传递到细胞中,而他们的 EditPro 转染试剂能够传递进人类原代细胞以及细胞系。“新的 EditPro 转染试剂依照 mRNA 的量,具有广泛的可调节剂量。”MTI globalstem 公司科学总监 James Kehler 说 除了优化 CRISPR 试剂,研究人员也正在以新的、创造性的方式来使用 CRISPR/Cas9 系统。例如,去除 “剪刀” 功能的 Cas9 变成一种有效的分子靶向的工具,可以将附加效应分子靶向到基因组的特定区域。不同的效应分子,如激活子、抑制子或者修饰子也已经被研究。MilliporeSigma 公司的 dCas9-p300 激活子就是一个融合了 p300 组蛋白乙酰转移酶结构域的非切割版本的 Cas9。一经结合,该激活子能够使附近的组蛋白乙酰化,为增强和持续的基因表达打开了染色质。 尽管基于 RNP 的 CRISPR 技术在近期大获成功,在用于功能筛选时,基于质粒技术还是存在一席之地。为了鉴定引发疾病的基因,一些公司提供了基于慢病毒 CRISPR 的基因敲除文库。美国西北大学费因伯格医学院小儿神经外科副教授 Simone Treiger Sredni 近期利用赛默飞世尔科技公司的 LentiArray CRISPR 文库去筛选 160 种影响细胞增殖的激酶的突变。Sredni 研究主要集中在寻找与儿童非典型畸胎样 / 横纹肌样瘤(atypical teratoid/rhabdoid tumors ,AT/RTs) 的治疗方案,这是一种侵入性和致死类型的儿童脑瘤。 Sredni 在一些特定的激酶中筛选了一致的突变,能够减少 AT/RT 细胞系的细胞增殖。她说,“其中一种激酶的抑制剂能够与缺失基因产生同样的效应,使得肿瘤不再生长。” 她也观察了利用高通量的基因表达平台进行的筛选,“这个基因从此不起作用了,因为它的表达水平是非常低的。” 接下来,Sredni 将研究抑制剂在小鼠移植瘤中的效应。 MilliporeSigma 公司还提供了基于慢病毒的,用于全基因组筛选 CRISPR 工具。通过与惠康基金会桑格研究所合作,MilliporeSigma 最近还为人类和小鼠的基因组构建了阵列式的全基因组 CRISPR 文库的,提供的格式、传递方式和范围(即单基因、基因家族,或整个基因组)都很灵活。 安捷伦公司日前也发布了集合性 CRISPR 筛选指导库,包括通过慢病毒载体传递的 CRISPR 基因敲除文库,包括了人类和小鼠的基因组尺度。为了获取充分的灵活性,安捷伦还提供了前扩增和不扩增的用户定制文库。“我们的 CRISPR 集合库利用 CRISPR/Cas9 在整个基因组上进行敲除,在功能筛选中被广泛使用。”安捷伦公司分子和合成组诊断和基因组生物学全球营销总监 Caroline Tsou 说,“通常这种敲除用来确定参与的细胞反应的基因,如信号转导通路,或发现新基因的功能。”安捷伦还提供长达 230 个碱基对的定制化的寡核苷酸,能给研究者 “探索文库其他用途的自由。” 她说。 但有时当细胞在被迫表达细菌核酸酶时,状态都不是太好。Dharmacon 公司的 Edit-R 诱导慢病毒 Cas9 系统对于那些不愿意在稳定细胞系中长时间含有核酸酶的研究人员来说,是 “一个很好的妥协。” 巴斯金说。“诱导系统发挥了最好的一面,因为当准备使用向导 RNA 处理细胞时,他们可以开启核酸酶的表达,得到充分表达的 Cas9,随后在完成切割后再将它关闭。” 与此同时,各种各样的 CRISPR 试剂已经为了对抗疾病准备就绪,特别是使用无 DNA 的方法。比如,RNP 方法的快开、快关的特性非常适合治疗性应用,CRISPR 试剂可以定向切割随后迅速降解。 但是纠正基因缺陷并不像敲除基因那么容易,因为通常行使功能的基因也必须被引入到正确的位置上。位于斯坦福的 Porteus 实验室最近发表了概念验证的 CRISPR RNPs,用于靶向β- 球蛋白基因,该基因的突变导致镰状细胞病。他们发现 CRISPR 可以修正这种疾病患者的人类造血干细胞中的β- 珠蛋白基因缺陷。此外,在加州大学伯克利分校的一个实验室独立地完成了一个类似的 CRISPR 编辑β珠蛋白基因的结果,使用稍微不同的方法来进行基因修正。 综合起来,这些工作给即将进行的人体临床试验带来了福音。2016 年 6 月,美国国立卫生研究院在美国批准的第一个临床试验,将使用 CRISPR 编辑人类 T 细胞帮助改善癌症治疗,预计该实验要持续到 2017 年。 同时,Porteus 实验室正在着手将 CRISPR 编辑的细胞用在病人身上,他们期望能在 2018 年开始临床试验。他们可能首先针对镰状细胞病,其次是严重的联合免疫缺陷(SCID)。Porteus 实验室不仅希望利用 CRISPR 修正突变,同时能够给细胞增加新的特性,从而可以治疗疾病,“例如抗 HIV 的免疫系统,或创建能够传递蛋白质到脑部的细胞。” 他说。“在科学和医学的生态链中,我们觉得自己的角色应该是将这些技术带给病人。” 随着 CRISPR 研究工具的飞速发展,以及将于近期开始的临床试验,我们与目标的距离可能比想象中更近。