《Cell: 新型CRISPR转录组学编辑“机器”有助于重塑转录组记忆》

  • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者: hujm
  • 发布时间:2021-04-12
  • 基因编辑技术的进步大幅提升了我们修饰人类基因组的能力。基于sgRNA介导的CRISPR- Cas9相关基因编辑技术能够在指定位点引入DNA断裂以失活基因功能或通过同源性DNA修复引导精确的DNA编辑,这些技术已针对基础DNA序列的靶向变化进行了优化,因此非常适合修复或引入致病性突变。然而,上述技术对内源性DNA修复机制的依赖提出了挑战,因为这些途径的复杂性可能使其难以进一步提升精确性。

    调节基因功能的另一种方式是在表观遗传学水平进行影响,从而控制基因表达而无需改变基础的DNA序列。此前研究已经表明,失去催化活性的dCas9可以增强(CRISPRa)或抑制(CRISPRi)哺乳动物细胞中的基因转录水平。可编程的表观基因组编辑是可调的,可逆的,并且不需要DNA断裂,有效地绕过了与基因编辑相关的细胞毒性。但是,当前的可编程表观基因组编辑技术通常依赖于dCas9融合蛋白的组成型表达来维持转录控制。因此,这些方式仍然不太适合细胞治疗和生物工程的应用。

    最近的工作表明,表观基因组编辑有可能编写一种稳定的转录程序,该程序可以被人类细胞记住并传播,而无需可编程表观遗传调节剂的组成型表达。 此外,可以通过募集DNA甲基转移酶和KRAB结构域的混合物来沉默基因。然而,迄今为止,表观遗传记忆编写程序仅对少数内源性人类基因进行了沉默测试。此外,以前的可编程表观遗传沉默子设计为每个靶基因使用两个或三个融合蛋白,这在实验操作上很麻烦(尤其是对于多重基因靶向),从而使得基因靶向策略更加复杂。此外,基于TALE的KRAB与DNMT3A和DNMT3L结构域的融合导致基因沉默效率的长期低下。目前尚不清楚这些方法对于建立具有“遗传性”的基因沉默技术的通用性以及是否存在编写和维持可遗传表观遗传沉默程序所需的基因组特征。对此,一个合理的假设是:由单个失活Cas9融合蛋白组成的表观遗传编辑元件将有助于广泛地探索“可遗传”表观遗传基因沉默技术的实用性。

    在最近发表在《Cell》杂志上的一项研究中,来自UCSF的Jonathan S. Weissman团队介绍了一种名为“CRISPRoff”的技术,包括其设计理念,开发过程和技术验证,CRISPRoff是一种可编程的表观遗传记忆编写器蛋白,可以持久抑制基因表达。

    研究发现,CRISPRoff的瞬时表达编写了一种表观遗传程序,从而维持人类细胞450多次的细胞分裂,突显出这种形式的基因沉默是稳定且可遗传的。 CRISPRoff表观遗传记忆可以使用称为CRISPRon的多部分表观遗传编辑器进行逆转,该编辑器可特异性删除DNA的甲基化修饰并募集转录元件。

    使用全基因组CRISPRoff筛选,作者证明了这种方法可以持久且特异性地沉默绝大多数蛋白质编码基因,并且具有广泛的靶向性。此外,对于CRISPRoff介导的稳定基因沉默而言,规范的CpG岛标签不是必需的。

    最后,作者证明了CRISPRoff可用于在人类干细胞中介导沉默增强和工程化的基因沉默程序,这些程序在神经元的不断分化过程中持续存在。总而言之,该系统使研究者们能够广泛探索表观遗传沉默的生物学规则,并提供了一个强大的工具来控制基因表达,靶向增强子以及探索表观遗传的原理。

  • 原文来源:https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00353-6?dgcid=raven_jbs_aip_email;https://news.bioon.com/article/6786303.html
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    • 2024年2月29日,苏黎世大学的研究人员在 Cell 期刊发表了题为Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies的综述论文。在这篇综述中,作者讨论了CRISPR基因编辑技术在研究和治疗方面的现状,强调了限制它们的局限性和近年来开发的技术创新来解决这些问题。此外,还检查和总结了基因编辑在人类健康和治疗方面的当前应用情况。最后概述了未来可能影响基因编辑技术及其应用的潜在发展。 基因组编辑,即对生物体遗传物质进行精确和有针对性的修改,是分子生物学领域最重大的进展之一。它具有深远的应用,从揭示基本的生物学过程到推动医学、农业和生物技术的发展。随着2023年底首次批准基于CRISPR疗法用于人类疾病治疗,CRISPR基因组编辑正在进入一个新时代。该综述旨在提供CRISPR基因组编辑全景视角,强调其当前状态、潜在的未来发展以及必须克服的障碍,以充分实现其在人类医学中的承诺。 CRISPR-Cas核酸酶的可编程性使其能够产生位点特异性的DNA双链断裂,从而使其能够快速适应基因组编辑技术。来自化脓链球菌的典型Cas9蛋白(SpCas9)是第一个被用于基因组编辑的Cas核酸酶,由于其固有的高活性和特异性,目前仍然是最广泛使用的基因编辑器。Cas12a是一种起源于V型CRISPR-Cas系统的Cas核酸酶,在Cas9之后几年被发现,同样被用于基因组编辑。与Cas9不同,Cas12a不需要tracerRNA进行激活,这一特点已被用于体内多重编辑。 CRISPR-Cas系统作为简单有效的可编程基因编辑工具的重新应用,极大地推进了许多基础和应用研究领域,为开发靶向基因治疗和各种生物技术应用奠定了基础。然而,高度进化的生物防御系统的功能特征与精确的基因组编辑工具的功能有所不同。因此,第一代基于CRISPR的基因编辑工具的应用潜力受到几个关键因素的限制,主要包括特异性、靶向范围,以及依赖内源性DSB修复机制来实现基因组编辑,此外,CRISPR组分的递送受到递送载体和目标细胞或生物体的特定限制。 自基于CRISPR的基因编辑首次展示以来,该领域已经得到了前所未有的发展。基于Cas9和Cas12a核酸酶的第一代DNA双链断裂依赖性基因组编辑器的功能已经通过不断创新得到增强,这些创新不仅增加了这些工具的多功能性,还提高了它们的精度并最小化了非预期编辑后果。然而,对于它们安全性的担忧仍然存在,这既是因为脱靶编辑活性,也由于靶向DNA双链断裂的潜在基因毒性效应。为了减少非预期编辑的发生,已经探索了多种方法来精确地控制CRISPR基因组编辑器。 CRISPR基因组编辑技术的发展带来了一系列具有显著潜力的应用,从基础研究的进步到新治疗方法的开发。首先,CRISPR已经改变了遗传学研究,使科学家能够在各种实验模型中模拟致病突变,创建大规模的全基因组筛查方法,并开发合成基因记录设备来研究正常发育和疾病进展。CRISPR系统还被被用于开发分子诊断,使病毒DNA或RNA的检测变得特异、快速和灵敏。其次,CRISPR技术还被用于建立消除病毒或细菌人类病原体的策略,后者是通过开发工程噬菌体实现的。限制病原体传播的一个具体例子是基于CRISPR的基因驱动,其中引入特定的抑制性特征(例如雌性不育),以摧毁携带病原体的昆虫种群(主要是传播疟疾等疾病的蚊子)。最后,过去十年的CRISPR基因组编辑已经发展出多种治疗遗传病的方法,其中一些已经从基于细胞和动物模型的临床前研究进入了人类临床试验。这包括体内和体外治疗纠正策略。体内治疗纠正方法涉及将基因编辑组件输送到人体内部受影响的组织。相比之下,体外方法涉及从患者身上收集细胞,在实验室中编辑它们,然后将编辑后的细胞移植回患者体内。此外,体外CRISPR编辑还使自体和异体基因组修饰的细胞疗法的产生成为可能,主要用于癌症免疫治疗。 随着当前CRISPR技术的局限性在过去十年中变得越来越明显,新的方法和方法学不断发展和优化,以解决这些限制并提高基于CRISPR的基因组编辑的效率和多样性。这些新兴的第三代工具和技术,包括最近发现的紧凑型RNA引导核酸酶类,这些核酸酶已被用于基于DNA双链断裂的编辑,并可作为其他基因组编辑器(例如碱基编辑和先导编辑)的RNA引导的DNA结合平台。 在基因组编辑领域,向宿主基因组中插入大片篇的DNA序列,特别是在缺乏同源定向修复(HDR)的非分裂细胞中,仍然是一个主要的未满足需求。在这种背景下,CRISPR引导的重组酶和转座子的开发提供了一种有前途的和潜在强大的途径来填补这一技术缺口。基于逆转录转座子的基因组编辑技术和编辑RNA转录本的新方法也已经出现。最后,新的基因组编辑工具的创建继续与递送方法的发展相伴而行,这对治疗应用构成了重大挑战。 总的来说,这些进步反映了快速发展的基因组编辑领域的动态,其中每种新方法都提供了互补的优势,以解决基因操作的各种需求和挑战。 此外,对于DNA双链断裂的基因毒性以及同源定向修复(HDR)低效率的担忧进一步推动了“第二代”CRISPR技术的发展,这些技术在不依赖于DNA双链断裂形成和HDR的情况下介导基因组编辑,其中最具代表性的是碱基编辑器(base editor,BE)和先导编辑器(prime editor,PE)。目前可用的CRISPR基因组编辑技术主要包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、碱基编辑、先导编辑、转录调控、RNA编辑,这为基因组编辑提供了更具针对性的方法,特定技术特别适合某些类型的编辑或递送模式。但虽然这些基因组编辑工具包的新增内容对解决与规范化CRISPR基因组编辑相关的许多限制做出了显著贡献,但它们在编辑活性、特异性和递送方面仍然存在一些限制。 过去十年,基因组编辑领域从一个新兴的科学追求转变为一种变革性的生物技术力量。第一代CRISPR技术主要基于内源性修复或位点特异性DNA双链断裂(DSB),已被第二代技术,例如碱基编辑和先导编辑所补充,这些技术可以在不产生DSB的情况下直接靶向DNA修饰,通常被认为更安全,并产生更可预测的编辑结果。新兴第三代CRISPR技术正在开发中,以解决该领域中两个主要未满足的需求:实现大片段DNA序列的精确插入,以及通过表观基因组工程实现在没有任何基因组编辑的情况下进行基因调控。这些和其他技术的持续进步是由两种方法实现的:一方面,通过挖掘宏基因组来发现新的分子系统,另一方面,通过合成生物学和人工智能支持的分子工程。 基因组编辑的现状最好地体现在不断扩展的新技术和方法的组合中,这些技术和方法主要基于源自CRISPR-Cas系统的RNA引导分子工具,彻底改变了我们精确和轻松地操纵遗传物质的能力。当前的发展趋势表明,这些技术将继续得到改进,在特异性、效率和传递机制方面逐步提高。值得进一步研究的领域将包括开发更具特异性和免疫原性的递送载体、减少脱靶效应以及增强对编辑结果的控制,从而提高基因组编辑的准确性和精度。展望未来,与纯粹基于蛋白质的技术相比,核酸引导系统可能仍然是基因组编辑的核心,因为它们具有简单的可编程性和适应性。然而,它们的应用模式可能会演变,可能会转向更瞬时性的编辑方法,以最小化意外长期基因变化的风险,或者通过瞬时递送来最小化基因组的破坏和免疫反应。 随着第一代CRISPR技术已经通过体外编辑被批准用于临床治疗镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血等疾病,以及体内基因编辑疗法的出现,限制未来广泛的基因组导向的治疗发展的瓶颈将不再是缺乏安全、高效或精确的基因组编辑器。主要挑战将在于递送方法,特别是对于血液和肝脏以外的器官以及某些体外细胞类型。体内递送方法的进步,例如mRNA疫苗开发中所见,可能会显著促进CRISPR技术的应用。此外,即使是目前可用的CRISPR方法编辑的组织和细胞,也需要更多的基础研究来确定安全的编辑靶点。因此,随着新传递载体的开发以及致病变异及其纠正策略的表征,可以通过CRISPR治疗的疾病范围将不断扩大。预计CRISPR领域外的进展将有助于推动这些技术向新的方向发展,增强其功能。在这种背景下,人工智能(AI)的兴起将使我们能够准确地模拟复杂的基因组编辑场景,预测靶向和非靶向编辑结果,并设计更强大的基因组编辑器,从而加快实施安全治疗方法的步伐。 伦理和社会影响,特别是涉及人类生殖细胞基因组修改的问题,将继续成为基因组编辑讨论的前沿。随着人类体细胞编辑成为现实,治疗性和非治疗性生殖细胞编辑的前景,以及对人类基因组进行可遗传改变的潜力,提出了深刻的伦理问题,全球社会必须加以解决。由于人类胚胎的研究表明,CRISPR基因组编辑技术在用于生殖目的的生殖细胞编辑方面不够安全或有效。此外,生殖细胞编辑的治疗效用有限,可能只对少数人有益。然而,对于基因组编辑技术的治理和负责任的管理,国际共识的紧迫性不能被夸大,特别是考虑到其快速发展、不断改进和广泛采用。 总的来说,尽管存在这样那样的挑战,但CRISPR基因编辑的未来是光明的。它不仅有潜力推动研究突破和革命人类医学,还有潜力提高农业生产和应对气候生态挑战,从而为子孙后代建立一个更健康、更可持续的未来。
  • 《CRISPR-Cas13a介导的精确定点RNA编辑的人工机器》

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    • 编译者:zhangyi8606
    • 发布时间:2018-06-15
    • 中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所的研究人员发表了题为“Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing”的研究论文,报导了一个利用新发现CRISPR家族中的Cas13蛋白(VI 型)、及其指导RNA(guide RNA)靶向结合特异序列单链RNA的能力,通过设计改造并与人源的RNA脱氨酶催化结构域(hADAR2d)结合,实现了精确定点RNA(A→I)编辑的人工机器。与近年来利用CRISPR家族蛋白(例如Cas9)对DNA编辑来修改基因/调控基因表达不同,Cas13体系不涉及编码基因DNA的改变,而是通过对基因转录产物(mRNA)进行编辑,为改变基因功能和调控表达提供了新的方法和思路。 这一研究成果公布在国际学术期刊《Nucleic Acids Research》上,由植物生理生态研究所李轩研究组等处完成。 近年来利用 CRISPR技术对生物物种基因DNA的编辑(包括切割和碱基替换),获得了巨大的成功,同时也面临技术上的限制。与DNA编辑技术互补,一个针对RNA的精确定点编辑技术,有独特的技术优势和应用。与DNA编辑技术相比,RNA的定点编辑不改变编码基因本身(DNA碱基改变后不能逆转),在时间上、空间上、和效率上更加可控。同时,RNA编辑可以同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有转录产物(尤其是对多倍体的物种),所以更加高效。在对疾病的基因治疗领域,利用RNA定点编辑修复疾病组织的突变基因,有着重要的应用价值。 为了实现精确定点RNA编辑的人工机器,李轩研究组与杨晟研究员、中国科学院上海巴斯德研究所郝沛研究员、及美国密歇根大学王红兵教授合作,对新发现CRISPR家族中、具有结合特异序列单链RNA能力的Cas13a,首先在模式生物裂殖酵母(S pombe)中实现了其靶向内源RNA和降解靶标RNA的功能。 进一步,研究人员设计利用Cas13a的改造产物dCas13a(丧失RNA切割活性的突变),将dCas13a与人源的RNA腺嘌呤脱氨酶催化结构域(hADAR2d)融合,引入到裂殖酵母中;再通过设计RNA编辑机器的靶向“零件”-指导RNA,实现了对内源RNA的精确定点编辑。 为了对RNA定点编辑机器的设计和参数(编辑碱基位置、距离、指导RNA结构和长度等)进行优化,研究人员构建了一系列不同的设计,并利用一个双荧光报告(reporter)系统来测试不同设置的编辑效率,从而获得了精准RNA编辑机器的最优参数。优化后的编辑机器对内源靶标RNA的编辑效率达到了59%。 最后,这项研究实现的精准RNA编辑机器的功能,进一步体现在对裂殖酵母反转录转座子Tf1突变株的修复和操作的实验中。Tf1与动物细胞的逆转录病毒类似,其跳跃和扩增需要经过中间体RNA的逆转录步骤。研究人员利用精准RNA编辑,恢复了Tf1突变株的转座能力,这个应用对逆转录病毒干预和操作提供了一个有潜力的工具。 原文标题: Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing