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《Cell | 合成敲除序列的模块化组合发现，用于编程持久细胞疗法》

  • 来源专题：战略生物资源
  • 编译者： 李康音
  • 发布时间：2023-09-26

  • 2023年9月14日，加州大学旧金山分校基因免疫学研究所的研究人员在Cell所发表的一篇名为“Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies”提供了一种新型基因编辑技术。这项技术被命名为“模块化集合基因敲除筛选"（ModPoKI）”，利用类似于乐高的能力，能在短时间内快速搭建出数千种不重样的基因编辑组合，进而在免疫细胞中进行不同测试。而该研究团队也利用ModPoKI筛选出了一种新的基因组合，将其加入免疫细胞中后，明显延长了细胞寿命，并增加了抗癌效果。

    展望未来，预计ModPoKI将在NK细胞、B细胞和髓细胞治疗、诱导多能干细胞衍生治疗等方面设计新的基因程序。另外ModPoKI将加速候选候选物的选择和设计优化，用于基础生物学发现和多种细胞治疗。未来的研究可以利用ModPoKI在更具挑战性的情况下进行体内筛选，如实体瘤异种移植。总之，未来的ModPoKI实验将有机会在这些研究的基础上探索更大的序列空间，包括更多的合成基因结构、跨越疾病模型、更加接近人类病理。



    本文内容转载自“ bioSeedin柏思荟”微信公众号。

    原文链接: https://mp.weixin.qq.com/s/wTENXMJ_kA-E2IUTAMIaYA

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相关报告

  • 《述评 | 细胞化学重编程》
    • 来源专题：战略生物资源
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2023-09-28
    • 2023年8月7日，浙江大学祝赛勇团队在Nature Cell Biology上发表题为A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state的论文。该研究通过大规模的小分子筛选，对重编程步骤加以进一步细分，让化学重编程的速率得到大幅提升，甚至接近转录因子重编程的速率，借此提供了一个全新的快速化学重编程体系（FCR，fast chemical reprogramming）。 一方面，这有助于探索化学重编程乃至细胞命运重塑的机制；另一方面，他们也成功找到多个调控细胞命运转换的小分子药物，从而有望用于再生、抗纤维化甚至抗衰老。其中，FCR 的建立能够极大加速对于细胞命运决定与转换分子机制的研究。多能性重编程作为细胞命运调控的核心体系，对其进行深入研究和理解，可以揭示细胞命运决定与细胞命运转换的底层逻辑，从而破解细胞身份密码、逆转发育时钟，有望实现多重应用场景。就重编程技术本身而言，此次筛选出来的小分子有望促进人细胞化学重编程或其他细胞类型之间的转变，从而帮助获得效率更高、质量更高的种子细胞或功能细胞，进而用于再生医学、疾病建模和药物筛选。此外，就小分子本身而言，其中一部分小分子或小分子鸡尾酒可以提高细胞的可塑性，故可用于向损伤部位进行局部用药，通过刺激细胞再生来实现治疗目的。同时，基于细胞重编程原理衍生的抗衰老应用也很值得期待。 化学重编程有何不同？ 细胞重编程，是细胞生物学和发育生物学的核心科学问题之一，近百年以来，该领域诞生了众多激动人心的划时代科技进展，比如克隆、诱导多能干细胞、化学重编程等。目前，人们对于细胞重编程分子机理的认知仍然存在很多不清晰的地方。虽然传统转录因子重编程和化学因子重编程的起点和终点是一致的，例如从皮肤细胞重编程到诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC）。但是，传统转录因子重编程和化学因子重编程两者之间的路径却不尽相同。打个比方，一个人从杭州到北京，既可以通过京杭大运河坐船到达，也可以乘飞机或坐高铁。转录因子重编程，采用直接过表达外源多能性转录因子的方式，比如 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 等转录因子。这些转录因子具有结合 DNA 能力，会结合到基因组的很多位点，从而能够关闭起始细胞的基因表达网络，同时能激活内源的多能性基因表达网络，进而实现 iPSC 的诱导。而化学重编程使用的是靶向信号通路、表观遗传和细胞代谢的化学小分子组合，借此模拟外界环境的刺激，进而逐步激活内源多能性基因表达网络。当利用这种手段时, 细胞的命运重塑较为曲折。也有观点认为，化学重编程与蝾螈等肢体再生过程十分类似。 而该团队提出的快速化学重编程（Fast chemical reprogramming, FCR）体系，其基于更加精准动态的诱导方式，总共采用 6 步法。当采用这种方法时，该课题组观察到很多早期发育相关基因会被激活，进而参与目标细胞的基因激活、以及细胞命运的转换过程，这一过程更加类似于发育程序的细胞身份转变。 化学重编程发展现状如何？ 从技术角度而言，化学重编程已被证明是可行的，并且能够用于不同胚层来源细胞或用于不同遗传背景的细胞。而该团队此次提出的新方法，首次实现并证明化学重编程在速率上能够接近传统转录因子重编程。从机制角度而言，此前已有研究报道过化学重编程的单细胞转录组数据或表观组数据。而本次研究则系统性地整合了转录组学、以及包括多个组蛋白修饰和 DNA 甲基化修饰的表观组学数据，从宏观层面为化学重编程机制研究打下了基础。然而，由于小分子靶点的多样性以及细胞命运重塑的复杂性，多个小分子组合到底以怎样的方式产生协同作用？以及如何正确地将细胞引向多能性重编程？对于背后的具体机制，学界依然不甚清晰。目前，化学重编程实验的对象主要是小鼠成纤维细胞，所以该类实验需要在细胞水平进行。由于技术原因、以及动物体内环境的复杂性，当前很难在动物体内实现精准的小分子组合靶向递送。有意思的是，早年已有学者利用转录因子，在小鼠体内进行部分重编程。另有学者利用病毒载体向小鼠眼部，以特异性的方式实现重编程因子瞬时过表达，从而成功逆转小鼠视网膜神经细胞的衰老，并恢复了衰老小鼠和青光眼小鼠的视力，证明多能性重编程本身具有激活细胞潜能的作用。那么，类比到化学重编程，或许也能针对衰老或损伤部位，以药物组合靶向递送的方式，来增加细胞的可塑性，从而刺激细胞再生，进而实现原位组织再生。 从国内到国外，跨越 15 年的一系列研究 事实上，早在 2008 年即在诱导多能干细胞（iPSC）技术诞生不久之后，祝赛勇就投身到细胞重编程的化学小分子筛选之中，并于 2010 年在 Cell Stem Cell 上发表论文，率先报道了利用单个转录因子和小分子组合实现细胞重编程的成果。2015 年，回国建立独立实验室之后，他立马搭建实验平台，就是希望能够建立高效、快速的化学重编程。 2016 年，刚启动筛选测试的时候，他和团队就遇到一个棘手难题。实验所需的细胞严重不足，于是他们赶紧从外部公司购买 Oct4-GFP 小鼠。然而当他们第一次取出成纤维细胞并进行化学重编程时，却几乎没有出现荧光，这让课题组既着急又困惑。一开始，他们怀疑是技术不稳定的原因。后来，才发现相比 OG2 品系小鼠，Oct4-GFP 品系小鼠由于报告基因拷贝数较少的原因，因此荧光会弱很多。但在当时他们已经开始进行大规模小分子筛选，原有的 OG2 成纤维细胞数量告急，眼看着课题即将停滞。后来经过多方努力，他们才解决了细胞来源问题。时间很快来到 2018 年，当时课题已经取得了不错进展。这时，重编程的优化已经接近 14 天。与此同时，也面临竞争压力。“好在课题组一起积极调整心态，坚持自己的步伐，又经过一年的筛选和优化，建立了时间周期为 12 天的体系。这时，大家反而沉下心，又花了大半年时间，尝试了所有能做的测试和优化，才建立了目前时间周期最快为 1 周的 FCR 体系。”祝赛勇说。 2019 年，在 FCR 系统构建成功之后，课题组成员非常好奇系统之中具体发生了什么。为此，他们先是进行了转录组测序。可是，在对转录组测序进行常规分析之后，还是一直理不出头绪。于是，在对重编程过程中的转录组数据进行两两比较之后，他们意外发现 FCR 后期经历了一个“滞育”类似状态。胚胎滞育，是指哺乳动物的胚胎在应对外源环境或激素作用下，发生胚胎的新陈代谢减缓甚至停滞，期间伴随着胚胎植入的滞后。而在退出滞育状态之后，胚胎仍然可以正常发育成为完整个体。此次研究发现：在 FCR 后期细胞的基因表达模式，类似于体内滞育囊胚的基因表达模式，包括下调与细胞分裂和蛋白质合成的相关通路。实验中，课题组证明 FCR 后期细胞的 DNA 和蛋白质的合成速率显著下调，这证明了滞育类似状态的存在。有趣的是，在对相关数据进行对比之后，他们发现滞育类似状态是 FCR 后期一种独特的状态。当对滞育类似状态进行抑制之后，则会导致重编程效率的显著下降。 此后，如何分析和关联大规模多组学数据成了最大的难题。2021 年底，经过所有组员的努力终于发现了 H3K9me3 修饰的独特之处，并分析得出如下结论：H3K9me3 会抑制多能性相关的 ERV，从而调控重编程的机制。H3K9me3，是一种可以抑制细胞多能性重编程的异染色质修饰。然而，以往关于 H3K9me3 在细胞重编程的研究，主要集中于研究它对基因的调控作用。而在本次研究之中，他们发现 H3K9me3 主要能够修饰基因组上 ERV 富集的基因稀疏区域。通过一番筛选，他们找到多个受到 H3K9me3 抑制的多能性相关 ERV，这些 ERV 在 FCR 后期会被显著激活。 实验中，该团队进一步证明 H3K9me3 会通过抑制多能性相关 ERV，从而形成重编程的障碍。这一机制的发现，再次说明在细胞命运转变过程之中，表观遗传修饰可以通过调控 ERV 表达，从而影响细胞身份的建立。此外，通过研究化学重编程的全过程，该团队提供了高质量的转录组学数据和表观组学数据。通过这些数据他们系统性地描绘了 FCR 过程中细胞基因表达动态和表观遗传动态。 再生研究，永无止境 除本次成果之外，该团队在过去也积累了不少其他成果。课题组还表示：“近年来，我们实验室深耕化学重编程领域，在 Nature Cell Biology、EMBO J、PNAS 上连发多篇论文。下一步我们将集中精力，针对在这些研究中最新筛选的多个小分子，对其作用机制进行探究。”与此同时，该团队在干细胞基因编辑和胰岛前体细胞高效扩增及分化（ePP-islet）上也取得了一些进展，相关论文此前相继发表在 Science 子刊和 Nature 子刊。在这一系列研究中，课题组采用了多种筛选方法，一方面他们参考已有文献中报道的小分子，另一方面则大规模地自行筛选小分子文库。 目前，利用直接模仿转录因子的方法，来设计化学小分子依旧比较困难。不过，利用化学小分子直接或间接调控转录因子，是一个可行的有效方案。例如，利用小分子可以直接激活内源转录因子，从而促进化学重编程。在实践中，尽管广谱盲选的手段既耗时又耗力，不过这依然是目前比较有效的手段，并能帮助发现一些有趣的分子机制。未来，随着人工智能、虚拟筛选等新技术的发展，必将助力实现通量更高、效率更高的小分子高通量筛选。可以想象的是，将来只需从病人身上取少量血液细胞，利用快速化学重编程技术，即可将其转变成可无限扩增的种子细胞，甚至可以通过基因编辑技术进行改造，再定向分化到具备生理功能的胰岛，从而有望治愈糖尿病。 整体来看，细胞重编程是一个非常神奇的生物学过程，蕴含着无限潜能，但是仍有很多未解的奥秘。再生和返老还童，是古老而又永恒的人类梦想与追求，这条道路永无止境，等待科学家们进一步的探索。 本文内容转载自“ DeepTech深科技”微信公众号。 原文链接: https://mp.weixin.qq.com/s/LfOTtL5bwFfXJN2UWzSHaQ
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  • 《化学之谜揭晓:研究人员发现了分子不寻常的细胞杀伤机制》
    • 来源专题：人类遗传资源和特殊生物资源流失
    • 编译者：yanyf@mail.las.ac.cn
    • 发布时间：2020-04-07
    • 2015年，杰克•伊顿(Jake Eaton)加入麻省理工学院(MIT)布罗德研究所(Broad Institute of MIT)和哈佛大学(Harvard)斯图尔特•施赖伯(Stuart Schreiber)的实验室后不久，这位博士后研究员就对同事们正在辩论的一些疯狂理论产生了兴趣。这些理论集中在一种被称为ML210的奇怪小分子上，它可以通过启动一种叫做铁作用的细胞过程来杀死细胞。Schreiber实验室的博士后Vasanthi Viswanathan发现，诱导上铁作用可以杀死一些耐药癌细胞。Eaton、Viswanathan和Schreiber认为，理解ML210如何触发这一过程，可以为如何开发治疗对现有疗法产生耐药性的癌症的药物，或在一开始就预防耐药性打开秘密。 伊顿和他的同事们知道，ML210通过抑制GPX4(一种保护细胞免受氧化应激的蛋白质)来诱导铁中毒。他们推测这是通过与蛋白质形成一种特殊的化学连接，称为共价键来实现的。问题是，ML210的化学结构没有明显的方式来形成共价键，这导致持怀疑态度的科学家对它如何能够与GPX4结合产生了一些牵强的猜测。 “我们想知道，‘它是否以一种不同的方式绑定GPX4 ?它是作用在GPX4通路的其他节点上，还是在做一些全新的事情?”,”伊顿说。“这是一个真正的化学之谜。” 现在，经过多年的研究，布罗德研究所的科学家们与拜耳公司的科学家们合作，已经解决了这个化学难题。在《自然化学生物学》的一项研究中，他们发现ML210在细胞内转变成一个新分子，这个新分子又转变成第三个分子，然后与GPX4共价结合。他们揭示的机制是极其不寻常的，并证明了一种未被认可的方式，即像ML210这样的“前药物”可以转化为分子，使其能够与细胞内的靶蛋白共价结合。 在这项研究中，科学家们描述了一组新的化合物，他们可以利用这些化合物来进一步了解细胞是如何进行上铁作用的。上铁作用是10年前才发现的一个过程。此外，这些分子是开发化合物的起点，这些化合物不仅可以在培养皿中抑制GPX4并杀死耐药癌细胞，还可能用于动物模型甚至病人。 “我记得我说过，‘恐怕我要把这个ML210的秘密带进坟墓’，”合著者施赖伯说。施赖伯是布罗德研究所的联合创始人和核心成员，也是哈佛大学化学和化学生物学系的莫里斯·勒布教授。就像剥洋葱的许多层一样，杰克一步一步地揭示了细胞赋予ML210的迷人的化学反应序列，这在有机化学中几乎没有先例。这是杰克出色的分子侦查工作。” 绑定之谜 近10年前，曾在施赖伯实验室学习的现为哥伦比亚大学教授的布伦特•斯托克韦尔首次正式描述了上铁血症。在上铁作用中，细胞膜上的脂质分子被氧化，导致一种叫做脂质过氧化物的有毒分子积聚，最终杀死细胞。GPX4通过将脂质过氧化物转化为无毒化合物来保护细胞免受这种死亡。 维斯瓦纳坦是从斯托克韦尔实验室移植到施赖伯实验室的，他推断一种能破坏GPX4的分子可能会成为一种新型抗癌药物的灵感来源。然而，GPX4是一个具有挑战性的目标，因为它平坦、无特征的化学结构没有明显的药物结合部位。 2010年,一个小分子发现努力叫做分子图书馆调查生产中心网络,广泛的研究所的部分,发现了一些化合物结合GPX4和诱导ferroptosis——其中两个属于一个类的分子称为氯乙酰氨,共价结合GPX4。但这些化合物不适合用于药物开发或动物研究，因为它们具有高度的活性，会破坏许多其他蛋白质，导致意想不到的副作用。它们也不太可能在体内停留足够长的时间来结合和阻止GPX4。 2010年筛选的第三种化合物是ML210，这是一种“离群化合物”，在化学性质上与氯乙酰氨基化合物不同。Eaton和Viswanathan研究了来自癌症治疗反应门户网站的ML210数据，该网站是由Broad的研究人员开发的数据库，部分由国家癌症研究所(National Cancer Institute)赞助。从数据上看，ML210通过与GPX4形成共价键，与氯乙酰氨基类似。令研究人员感到困惑的是，ML210不包含“共价弹头”，这是一种关键的化学结构，可以让它以这种方式与GPX4配对。 前所未有的机器 为了探究ML210是如何抑制GPX4的，该团队需要更好的方法来在实验室中研究GPX4。他们与拜耳的同事开发了一种系统，可以在哺乳动物细胞中过度表达GPX4蛋白，并制作了一些实验来研究分子与GPX4之间的相互作用。 伊顿说:“这种特殊的产学研合作的一大好处就是克服了我们在这项研究中遇到的一些问题。”“我不认为我们凭一己之力就能克服这些挑战。” 分析证实，ML210实际上是通过共价结合抑制GPX4的，而且其抑制作用比两种氯乙酰氨基化合物要精确得多。 这一暗示导致伊顿进一步的化学探测工作，揭示了ML210在细胞中经历了一些不寻常的化学转变，以获得结合和抑制GPX4的能力。ML210首先被转化成一个化合物，该团队将其命名为JKE-1674。细胞将这种化合物转化成另一种不同寻常的分子JKE-1777，这种分子能够与GPX4共价结合。 尽管JKE-1777在细胞外是不稳定的，但该团队合成的JKE-1674和相关化合物对GPX4是稳定的和选择性的，比ML210更适合用于动物模型，甚至病人。 前所未有的机器 在《美国化学学会杂志》的一篇相关论文中，研究人员描述了另一组化合物diacylfuroxans，它也能共价抑制GPX4。虽然这些化合物的选择性不如ML210或JKE-1674，也不太可能有治疗作用，但这项联合研究帮助科学家理解了ML210研究中的新发现。 “这些化合物是化学生物学历史上前所未有的分子机器，因为它们具有不同寻常的多层化学特征，而这些特征是它们的特性的基础，”Schreiber实验室的博士后助理Vasanthi Viswanathan说。 还有更多的工作要做，以确定是什么细胞过程引导ML210转化为其活性形式，以及这些分子是否可以用于动物模型，甚至用于人类作为治疗化合物。 如果这些分子或它们的变体被证明是有希望的新疗法，它们可能会产生一种新的药物，有一天可以帮助对抗耐药肿瘤。
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