《基因编辑器CRISPR让突变小鼠触手可得》

  • 来源专题:转基因生物新品种培育
  • 编译者: 丁倩
  • 发布时间:2016-12-07
  • JAX实验室利用基因工程技术改造小鼠,以JAXR Mice为注册商标,并将其出售给研究人员。它喜欢这样自夸:这是全世界质量最好和发表次数最多的小鼠模型。为该实验室评估和研发新技术的Michael Wiles相信,这个由细菌和古生菌用于保护自身免受病毒侵袭的免疫策略巧妙改编而来的新工具将使JAX改造小鼠的方式发生革命性变化。

    长久以来,JAX和其他培育新的小鼠品系的实验室依赖于一个辛苦费力的多步骤过程,其中涉及利用基因工程技术改变小鼠的胚胎干细胞,将其注射进胚胎,并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的团队,也需要用2年时间才能成功改造一只小鼠。CRISPR利用一种可在受精卵上开展针对性基因手术的分子复合物替代了所有这一切。它能在6个月内产生一种被改造的小鼠。

    “当你在以前培育基因敲除小鼠时,需要具备一些技能。”来自麻省理工学院的Rudolf Jaenisch表示,“现在,你不再需要这些技能。任何傻瓜都能做。”

    研究人员不再需要改造胚胎干细胞并不辞辛苦地培育若干代小鼠,以产生卵子或精子细胞中携带基因突变的小鼠。同时,研究人员若想培育拥有两个突变的小鼠,也不再需要将单突变体杂交并经历一个类似的耗时且烦琐的流程,以获得拥有被改变生殖细胞系的小鼠后代。

    加拿大多伦多大学生物化学家Tak Mak认为,此项技术真正改变了获得这些被改造动物的时间和效率。据他估测,和利用胚胎干细胞相比,利用CRISPR改造小鼠的花费要便宜30%左右,从而使他的平均成本大大降低。

    CRISPR革命不只限于培育拥有生殖细胞系突变的小鼠。CRISPR还允许研究人员同时使若干疑似癌症基因在成年小鼠体细胞中发生突变。与此同时,CRISPR敲入可修正成年小鼠体内引发疾病的基因缺陷。若干研究小组计划将CRISPR注射进正在发育的小鼠体内,目标则是创建可发挥条形码作用的突变并且使科学家得以追踪细胞分化时的细胞谱系。

    不过,从某个方面来说,CRISPR革命步履蹒跚。在Jaenisch实验室首次报告CRISPR的3个月后,他和同事提出,CRISPR可轻易实施更加复杂的基因手术,即敲入DNA片段而非简单地令基因丧失功能。作为示范,他们利用CRISPR将荧光标记敲入小鼠受精卵。当特定基因被开启时,荧光标记便会亮起。研究人员还创建了对很多研究来说至关重要的条件突变体。

    约1/3的小鼠基因对于胚胎发育是必不可少的。如果这些基因从一开始就丧失功能,小鼠便不会诞生。因此,利用胚胎干细胞开展研究的科学家巧妙地设计出一种被称为Cre-Lox 重组的系统。该系统仅在小鼠发育到足以在失去上述基因仍能存活下来后才会将基因敲除。这需要添加额外的DNA:位于靶基因两侧的Lox序列和一个Cre基因。其中,Cre基因可被启动,以产生一种酶,用于修改Lox位点之间的DNA。Jaenisch团队利用CRISPR将同一系统插入受精卵,并且报告称以相对较高的效率培育出条件小鼠——约16%的受精卵产生了拥有正确突变的小鼠幼崽。但在JAX实验室,产生拥有正确突变的小鼠幼崽的受精卵仅占1%或2%。同时,很多项目正走向失败。很明显,它并未被证实为一种稳健的方法。”

    无论目前CRISPR看上去有何种缺点,Wiles强调说,它在改造小鼠方面的潜力不应当被忽视。“CRISPR能做的事情有很多,而我们才刚刚开始入门。”

相关报告
  • 《碱基编辑恢复了小鼠的部分听力》

    • 来源专题:人类遗传资源和特殊生物资源流失
    • 编译者:yanyf@mail.las.ac.cn
    • 发布时间:2020-06-09
    • 来自波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital)、麻省理工学院(MIT)和哈佛大学(Harvard)布罗德研究所(Broad Institute of MIT)的研究人员利用一种名为“碱基编辑”(base editing)的基因组编辑技术,在一种已知的隐性基因突变小鼠身上恢复了听力。 通过这项技术,研究人员修复了Tmc1基因中的一个单一错误,该错误已知会导致遗传性耳聋。这种一次性修复包括将一个错误的DNA碱基与正确的DNA碱基交换。虽然类似的方法以前也曾用于其他形式的听力损失,但这是首次将碱基编辑用于遗传性感觉障碍。 该方法的细节发表在《科学转化医学》的一篇新论文上。 “这项研究是非常重要的在波士顿儿童医院儿科的社区和其他地方,因为每年大约有4000婴儿出生遗传听力损失,”杰弗里·霍尔特说,耳鼻咽喉科主任F.M. Kirby神经生物学研究中心在波士顿儿童,研究与大卫刘和文章的第二作者,核心成员学院广泛和广阔的叫法变革性技术研究所主任医疗保健。“而且,我们认为这是听力恢复领域之外的一大步,对于更广泛的关注基因疾病治疗领域来说也是如此。” 基本编辑器充当拼写检查 霍尔特实验室和同事在2015年的早期研究表明,将Tmc1的完整DNA序列替换到耳朵的感觉细胞中,可以恢复失聪小鼠的听力。 他说:“在这种情况下,我们使用了一种单一的腺相关工程病毒(AAV)来将Tmc1基因的功能拷贝传递到耳朵。” 这项研究更进一步。该研究小组修复了Tmc1基因中的一个单一突变,并将其转换回正确的序列,而不是替换某个基因。“它就像你的拼写检查器,”他说。如果你打错了字母,拼写检查程序会帮你修复。当研究小组修复了耳朵感觉细胞的缺陷后,编辑过的细胞恢复了100%的功能。 但是基本编辑器对于一个AAV来说太大了。新设计的用于基因修复的基本编辑器需要更多的空间。它不能装进一个AAV。相反,他们将碱基编辑器序列拆分为两个AAVs。 “一旦细胞感染这些两部分,它能够重新组装成一个完整的序列,然后我们需要执行基本的编辑任务,”霍尔特的奥尔加Shubina-Oleini说实验室,谁是co-first作者研究Wei-Hsi刘叶的实验室。 重要的是要注意,当两个AAVs进入细胞时,方法是有效的。但在大约四分之一的细胞中,这种情况足以为老鼠提供一些听力。 霍尔特说:“我们让它起作用了,但我们需要提高效率,使其广泛使用。”如果只有一个AAV进入细胞,它就不起作用。“但我们得到的信息是,当我们同时进入细胞后,我们的功能从零到100%。这告诉我,我们所需要做的就是让它进入更多的细胞,我们将恢复更多的听力功能。” 以以往的成功为基础 至少有100种不同的基因与内耳的听力有关。任何一种突变都可能导致听力丧失。 “我们已经针对这些不同形式的听力损失开发了不同的策略,”霍尔特说。“这确实需要一种精确的医疗方法,我们试图根据具体情况调整我们的策略,不仅仅是涉及到的每个基因,在某些情况下,还包括基因中的单个基因突变,就像这项研究一样。” 霍尔特实验室有很长一段成功的历史,揭示了导致听力损失的遗传原因,并开发了基因治疗方法来治疗遗传性听力损失。2011年,研究小组首次发现Tmc1蛋白是听力和平衡所必需的。2017年,Liu实验室与马萨诸塞州眼耳部的研究人员共同开发了一种基于CRISPR-Cas9基因编辑的方法,用于修复Beethoven小鼠的Tmc1突变,这是一种显性Tmc1突变的模型。在2015年取得成功的基础上,Holt团队在2019年也使用了CRISPR-Cas9来防止听力损失。 这只是与听力和平衡有关的众多突变之一 在人类Tmc1基因中发现了70多种不同的突变。霍尔特说:“我们希望这项新技术能让我们一次拾取一个耳蜗,以恢复听觉和内耳的平衡。” 与听力丧失一样,平衡障碍是一种尚未得到满足的巨大医疗需求,尽管它主要存在于老年人中。内耳内有耳蜗(听觉器官)和五个平衡器官——前庭器官。这五种身体中任何一种的功能紊乱都可能导致平衡问题。 这项研究的其他贡献者包括波士顿儿童基金会的潘碧凤;布罗德大学的乔纳森·利维、格雷戈里·纽比、迈克尔·沃诺和乔纳森·陈;以及澳大利亚默多克儿童研究所的雷切尔·伯特。 这项研究的支持是由国家卫生研究院,哈佛休斯医学研究所,杰弗里和金伯利巴伯基金,和基金会的L 'Audition。 改编自波士顿儿童医院最初发表的一篇故事。
  • 《Science丨体内编辑肺干细胞,对小鼠进行持久基因校正》

    • 编译者:李康音
    • 发布时间:2024-06-19
    • 2024年6月13日,德克萨斯大学西南医学中心团队联合凯斯西储大学团队和ReCode Therapeutic合作在Science杂志上发表了题为In vivo editing of lung stem cells for durable gene correction in mice的研究论文。报道了肺部选择性脂质纳米颗粒(Lung SORT LNPs)成功在囊性纤维化小鼠模型的肺部实现对致病基因的修正。此项研究可能为囊性纤维化和其他遗传性肺病患者带来希望。 与常见的针对肺部递送的吸入法(由于给药方便,适合蛋白质替代疗法)相比,静脉注射的 SORT LNPs 通过避免疾病相关的粘膜屏障,并且由于肺内皮床与 LNPs 的紧密接触,可能更有机会进入肺基底干细胞。Siegwart团队最初使用经过基因改造的健康小鼠进行实验,使得经过基因编辑的细胞会发出红光。然后,他们通过静脉注射递送包含靶向肺部的基因编辑工具的 SORT LNPs。肺部持续的红光表明带有编辑基因的细胞至少存在了22个月。进一步的研究表明,超过70%的小鼠肺干细胞被基因编辑了。这种治疗方法对大约10%的囊性纤维化患者尤其有益,这些患者的疾病是由CFTR基因罕见突变或一种称为无义突变(例如 R553X)的特定突变类型引起的。Trikafta 无法治疗他们的疾病,而 Trikafta (Vertex)是目前囊性纤维化的黄金标准疗法。 在另一项实验中,研究人员使用 SORT  LNP对携带 R553X/F508del 突变的囊性纤维化患者分离出的肺细胞进行了碱基编辑,这些细胞在气液界面上培养,可以模拟肺部上皮细胞结构和功能,被认为是预测临床治疗效果的有力指标。实验表明,针对R553X突变基因的碱基编辑成功恢复了约53%的囊状纤维化跨膜转导调节子(CFTR) 的功能,这一结果与接受正对F508del突变的 Trikafta 治疗组在该实验中的结果相当。接下来,研究人员使用携带 R553X 突变的小鼠模型进行实验。尽管囊性纤维化的小鼠模型不会表现出人类囊性纤维化的呼吸系统症状,但它们确实与健康小鼠相比具有明显的生理差异。实验表明,碱基编辑在这种疾病模型中也取得了成功。 这些结果表明,基于器官选择性的脂质纳米颗粒 (SORT) 的基因编辑疗法有望长期治疗囊性纤维化和其他遗传性肺病。后续更多的研究需要在具有囊性纤维化症状的动物模型中验证这种方法,并确保这种潜在疗法的安全性。