本文由Civilization Ventures提供给您，这是一个专注于概念和健康技术的深度技术基金，以及Catalog，Manus和Evonetix等公司的早期投资者。作为一个连续创业者本人和投资者，他们有6个职业退出，价值数十亿，CV的创始人兼普通合伙人Shahram Seyedin-Noor努力帮助他的创始人实现他们的变革愿景。有关详细信息，请访问https://www.civilizationventures.com/
基于CRISPR的基因组编辑在合成生物学界引起了轰动。从字面上看，我们每周都会阅读一个新的突破，以便将CRISPR / Cas9用于多种应用。除了“典型”基因编辑，基因沉默和“困难”生物中的精密工程外，还有一些应用，例如用荧光蛋白标记染色体基因座，在DNA中记录细胞事件，以及基于CRISPR的癌症治疗的临床试验。马上开始。
然而，CRISPR核酸酶的一个方面有点被忽视：我们怎样才能破坏它们的活动？蛋白质抑制剂是常见的，并且鉴于大量小分子沉积在化合物库中，识别减少或完全破坏CRISPR / Cas9活性的那些应该是直接的任务。事实证明，CRISPR核酸酶在这方面也是独一无二的，并且抑制剂的鉴定具有挑战性。幸运的是，麻省理工学院和哈佛大学BROAD研究所的一个研究小组刚刚报道了可以作用于化脓性链球菌的CRISPR / Cas9的小分子的鉴定。
问题
Cas9
化脓性链球菌Cas9与指导RNA（橙色）和靶DNA（红色）复合。图片来自K Vavitsas（PDB：4OO8）
有几种应用可以从CRISPR抑制剂中受益。由于CRISPR / Cas9具有脱靶效应，限制活动时间窗口可以提高其精确度。特别是对于种系编辑应用，调制编辑可以减少镶嵌现象 - 由脱靶突变引起的由具有不同基因型的细胞组成的生物。在无细胞CRISPR应用中，开启和关闭CRISPR的能力提供了设计灵活性。在医学应用中，受控制的抑制可以通过仅在需要时激活蛋白质来减少CRISPR相关的细胞毒性。
CRISPR / Cas9与指导RNA（gRNA）和DNA分子的复合物非常具有挑战性。 CRISPR以皮摩尔亲和力结合DNA。 CRISPR以二聚体结合，复合物体积庞大。它具有一些独特的蛋白质折叠，并且为了抑制它需要二聚体的两种蛋白质的失活。本文由Civilization Ventures提供给您，这是一个专注于概念和健康技术的深度技术基金，以及Catalog，Manus和Evonetix等公司的早期投资者。作为一个连续创业者本人和投资者，他们有6个职业退出，价值数十亿，CV的创始人兼普通合伙人Shahram Seyedin-Noor努力帮助他的创始人实现他们的变革愿景。有关详细信息，请访问https://www.civilizationventures.com/
基于CRISPR的基因组编辑在合成生物学界引起了轰动。从字面上看，我们每周都会阅读一个新的突破，以便将CRISPR / Cas9用于多种应用。除了“典型”基因编辑，基因沉默和“困难”生物中的精密工程外，还有一些应用，例如用荧光蛋白标记染色体基因座，在DNA中记录细胞事件，以及基于CRISPR的癌症治疗的临床试验。马上开始。
然而，CRISPR核酸酶的一个方面有点被忽视：我们怎样才能破坏它们的活动？蛋白质抑制剂是常见的，并且鉴于大量小分子沉积在化合物库中，识别减少或完全破坏CRISPR / Cas9活性的那些应该是直接的任务。事实证明，CRISPR核酸酶在这方面也是独一无二的，并且抑制剂的鉴定具有挑战性。幸运的是，麻省理工学院和哈佛大学BROAD研究所的一个研究小组刚刚报道了可以作用于化脓性链球菌的CRISPR / Cas9的小分子的鉴定。
问题
Cas9
化脓性链球菌Cas9与指导RNA（橙色）和靶DNA（红色）复合。图片来自K Vavitsas（PDB：4OO8）
有几种应用可以从CRISPR抑制剂中受益。由于CRISPR / Cas9具有脱靶效应，限制活动时间窗口可以提高其精确度。特别是对于种系编辑应用，调制编辑可以减少镶嵌现象 - 由脱靶突变引起的由具有不同基因型的细胞组成的生物。在无细胞CRISPR应用中，开启和关闭CRISPR的能力提供了设计灵活性。在医学应用中，受控制的抑制可以通过仅在需要时激活蛋白质来减少CRISPR相关的细胞毒性。
CRISPR / Cas9与指导RNA（gRNA）和DNA分子的复合物非常具有挑战性。 CRISPR以皮摩尔亲和力结合DNA。 CRISPR以二聚体结合，复合物体积庞大。它具有一些独特的蛋白质折叠，并且为了抑制它需要二聚体的两种蛋白质的失活。
方法
Basudeb Maji和他的合作者专注于抑制Cas9与Protospacer邻接基序（PAM）的相互作用。虽然Cas9中有几个潜在的目标，但与PAM的相互作用已被证明对功能至关重要。为了研究相互作用（以及小分子如何阻碍它），他们开发了荧光偏振测定法：它们产生了一种DNA分子，其在PAM序列中结合了荧光团;该DNA与Cas9的结合将降低DNA的翻滚速率，导致荧光团发射的偏振光发生可测量的变化。
Cas9-DNA复合物不能自然地维持强烈的相互作用，因此研究人员生成了一个DNA分子，其具有结合位点的串联重复序列。这导致复合物以剂量依赖性方式表现并且适合于研究配体相互作用。为了增加一层冗余，研究人员开发了三种独立的基于荧光细胞的分析方法，其中Cas9核酸酶的活性破坏，抑制转录或激活荧光蛋白基因。
Broad博士筛选了数千种来自商业和天然化合物库的小分子。筛选产生两种化合物（BRD7087和BRD5779），其与Cas9结合并在所有测定中降低活性。利用这两种分子的化学结构作为指导，研究人员研究了结构相互作用并测试了相似的分子。表现最好的化合物BRD0539显示出以下有趣的特征：细胞渗透性，无细胞毒性，剂量依赖性反应和可逆作用。
为什么这项工作很重要？
虽然存在抑制CRISPR的蛋白质，但这些是不能渗透细胞膜并且稳定性差的庞大分子。特征性小分子抑制剂库克服了这些限制，并提供了容易地缓和或破坏CRISPR / Cas9活性的方法。
此外，开发的高通量系统可用于测试来自不同化合物库和其他CRISPR变体（例如CRISPR / Cpf1）的其他分子。 CRISPR-DNA复合物难以使用，Broad Institute团队提供的技术挑战解决方案可以成为进一步研究的垫脚石。
也许更重要的是，针对特定位点和改变CRISPR特征的小分子可以成为更好地理解和设计CRISPR自身的宝贵工具。一个这样的例子是抗生素对核糖体研究的贡献。小分子 - a.k.a.，抗生素 - 针对特定的翻译步骤并定期暂停该过程，确定蛋白质合成的确切分子机制和动力学，甚至帮助确定人类核糖体疾病的原因和微生物的抗生素抗性。小分子抑制剂最终可以在CRISPR研究中具有类似的效果，并且可能会产生更强大或专门的CRISPR核酸酶。
CRISPR在这里停留，这是一种精确的分子剪刀，可以开启基因组操作的可能性，否则这是不可能的。 事实是，这个工具还没有像我们想的那样具有良好的特征和易于使用。 Maji及其合作者的这项工作表明，我们可以解决与CRISPR相关的一些挑战，并可能促进越来越多创造性应用的开发。
——文章发布于2019年5月15日
