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《生产慢病毒以建立CAR-T细胞。》

  • 来源专题：实验室生物安全
  • 编译者： 张虎
  • 发布时间：2019-11-26

  • 一种最通用的基因转移方法涉及重组慢病毒载体的使用，因为它们既可以转导分裂细胞也可以转导非分裂细胞，被认为是安全的，并且可以提供长期的转基因表达，因为整合的病毒基因组（原病毒）可以通过子细胞。当修饰的细胞即使在多次细胞分裂后也必须继续表达转基因时，这些特性是非常理想的。慢病毒载体通常用于引入编码cDNA的蛋白质（例如报告基因），或用于非编码序列（例如RNA干扰或基因组编辑的介体，分别包括shRNA或gRNA）。在基因治疗领域，慢病毒载体已成功用于修饰造血干细胞，从而恢复了免疫功能或纠正了血红蛋白的缺陷，仅举几个例子。嵌合抗原受体（CAR）T细胞在治疗B细胞白血病和淋巴瘤方面的成功尤为引人注目，这种方法在很大程度上依赖于慢病毒介导的基因转移。在这里，我们介绍了生产慢病毒，通过超速离心浓缩和确定病毒滴度的典型方案。然后，所得病毒可用于基因转移的实验室分析，包括建立CAR T细胞。

  • 原文来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31707667
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相关报告

  • 《《科学》子刊封面：溶瘤病毒和CAR-T细胞联手根除实体瘤》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2020-09-09
    • 近日，《科学》子刊Science Translational Medicine发表的一篇研究论文中，美国希望之城国家医学中心（City of Hope National Medical Center）的科学家们将两种强有力的免疫疗法——溶瘤病毒和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法结合在一起，靶向原本难以单独用CAR-T疗法治疗的实体瘤，取得了重要进展。这项新研究有望让CAR-T细胞的治疗范围扩大到各种实体瘤患者。 “我们的研究表明，溶瘤病毒是一个强有力的方法，可与CAR-T细胞疗法结合，更有效地靶向实体瘤。”该研究的作者之一Saul Priceman教授说，“这一治疗平台解决了难以用免疫疗法治疗实体瘤的两大挑战。第一，实体瘤上，适合T细胞用CAR重定向的靶标有限。第二，实体瘤被所谓的免疫抑制性肿瘤微环境包围，当一种CAR-T细胞试图进入肿瘤，存活下来并杀死癌细胞时，会因为这种屏障而无法有效发挥作用。溶瘤病毒能够突破这一屏障。” 在这项临床前研究中，科学家巧妙地利用溶瘤病毒给CAR-T细胞配备了进军实体瘤的”司机"。他们通过基因工程改造了一种溶瘤病毒，使其进入肿瘤细胞，迫使细胞在表面表达截短的CD19（CD19t）。实验显示，这种溶瘤病毒（被称为OV19t）能在三阴性乳腺癌细胞系以及胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈癌、脑肿瘤细胞中起效。 在肿瘤细胞感染OV19t后，科学家们利用了特异性靶向CD19的CAR-T细胞识别并攻击这些实体瘤。 在体外实验和多种小鼠肿瘤模型中进行的测试显示，CD19t在肿瘤细胞中的表达比病毒杀死它们快得多，因而给靶向CD19的CAR-T细胞创造了时间窗口。而被杀死的肿瘤细胞释放额外的病毒拷贝传播给邻近的肿瘤细胞，使之成为CAR-T细胞的目标。因此，溶瘤病毒和CAR-T细胞的结合产生了强大的协同效应。 此外，在利用这种组合疗法根除实体瘤后，小鼠还表现出了长时间的保护性抗肿瘤免疫，免疫系统建立了对肿瘤的记忆反应。这一结果意味着这种联合治疗将有助于防止复发。 研究人员表示，他们现在正设计临床试验，用以在患者中测试这种组合。当然他们将首先在实体瘤患者中测试OV19t的安全性。如果证明安全有效，那么就可以依次测试溶瘤病毒和CAR-T细胞疗法。预计试验将于2022年开始。
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  • 《CAR-T开创者：90%的癌症有望通过“疱疹病毒+CAR-T”治疗！》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2022-11-04
    • 在过去五年中，FDA批准了六种非实体瘤CAR-T疗法：四种用于治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤，两种用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤。但是，2021年最新的全球癌症数据指出，约90%的癌症都是由实体瘤引起。虽然CAR-T在血液肿瘤治疗方面取得了进展，但是在实体瘤和治疗中并未取得很好的疗效。实体瘤抗原特性及其肿瘤微环境构成了“护城河”，让CAR-T难以“近身”，也是实体瘤难治的症结所在。 10年追踪，确认CAR-T可治疗血液瘤后，开启实体瘤攻坚战 Carl June是宾夕法尼亚大学的免疫学家，设计了全球第一种CAR-T治疗方法。作为全球第一个对CAR-T细胞技术进行人体研究的实验室，宾夕法尼亚大学Carl June的细胞免疫治疗实验室一直专注于改进和开发基于T细胞的新疗法，并发现了许多关键技术和基本原理。作为CAR-T技术风向标，Carl June在确定CAR-T可治疗血液肿瘤后，开启对实体瘤的攻坚。近日，Carl June宣布与溶瘤病毒公司Candel Therapeutics合作进一步验证单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）载体是否可以帮助CAR-T穿透实体瘤微环境，攻克实体瘤。 Carl June曾在2010年表示CAR-T根本不是一种治愈性疗法。为了验证这一看法，在过去的10年里，Carl June和免疫学家Joseph Melenhorst定期从2011年试验的第一批患者身上采集血液，追踪CAR-T细胞和癌细胞的变化。2022年2月2日，追踪成果以题为“Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells”发表在Nature上（图2）。该结果表明CAR-T细胞在治疗十年后仍然活跃，虽然数量较低，但仍可测量。通过在培养皿中培养提取的CAR-T和癌细胞，发现这些CAR-T细胞保留了对癌细胞的连环杀伤能力。 针对这一结果，Carl June表示：“这还不算是CAR-T疗效的确凿证据，但是反馈出只要癌症出现，患者体内的CAR-T就会‘像打地鼠一样’将其消灭。基于这些结果，我们现在可以得出结论，CAR-T细胞实际上可以治愈血液瘤患者，实体瘤的研究也可以更进一步。” CAR-T与血液肿瘤：狭路相逢“明”者胜 CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell）全称为嵌合抗原受体T细胞。它是一种通过人体自身免疫细胞来杀死肿瘤的免疫治疗。CAR-T疗法的基本制备流程是：从患者血液中提取免疫系统中的T细胞，并在实验室环境中为T细胞装备“导航装置”---CAR（肿瘤嵌合抗原受体），将T细胞打造成“鹰眼战士”，使其能够特异性识别癌症细胞；“改装”并被扩增培养到一定数量的“鹰眼部队”被回输至患者体内，与癌细胞正面交锋，利用机体自身的免疫反应破坏癌症组织。免疫系统可通过改造身体的自然防御从内部根除癌症，与标准治疗方式相比具有无可比拟的优势（图3）。 截至目前，全球上市的6款CAR-T疗法的适应症均为血液肿瘤，包括淋巴细胞白血病和骨髓瘤（表1）。CAR-T治疗现有疗法无效的难治性血液肿瘤的有效率高达50%-70%。那么，CAR-T失败的原因何在？ 不难发现，现有CAR-T产品靶点单一，但是狡猾的癌细胞是“多面派”，想要在茫茫“血海”中仅依靠单一信息找到癌细胞，难免会错过；此外，CAR-T细胞进入“战场”后的“武器”丢失，或者聪明的癌细胞调整策略，隐藏自己被锁定的特征，让CAR-T细胞找不到方向；再者，CAR-T细胞带的“武器”识别的不是肿瘤独有的“ID”，而是肿瘤相关的特征，这些特征正常细胞也有，就会导致CAR-T细胞“跑偏”，敌我不分。 因此，为了提高CAR-T细胞对癌细胞的“分辨率”，让CAR-T“看得明明白白”，多靶点CAR-T研究如火如荼。首当其冲的是靶点的选择与验证，其次是多靶点结构的优化，最后是新型CAR-T的技术优化与产品开发。未来，鸟枪换炮的CAR-T细胞将大有所为！ “高冷”的实体瘤，拒CAR-T于千里之外 现有的CAR-T产品都是针对血液肿瘤这种非实体瘤，而在实体瘤方面实在是有心无力。一方面，实体瘤细胞缺乏被定位特征---抗原的异质性以及特异性肿瘤抗原（tumor-specificantigen，TSA），使CAR-T自废武功，难以对肿瘤细胞进行精准的靶向性识别和杀伤；另一方面，实体瘤特殊的肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME），包括异常血管结构和基质成分组成的第一道物理屏障，以及TME中多种免疫抑制细胞、抑制性免疫及代谢分子组成的二次屏障（图4），两道屏障形成的“护城河”，让CAR-T细胞“过不了江”，同时导致其“出师未捷身先死”[2]。 要实现CAR-T治疗实体瘤，就要先“过河”再精准战斗。本质上“打铁还需自身硬”，通过各种手段为CAR-T叠加“Buff”，优化CAR-T的结构，提高“分辨”实体瘤的能力；其次，为CAR-T配备“先锋”，在前面“过河搭桥”，让CAR-T顺利打入实体瘤内部，联合作战。 Candel Therapeutics：HSV载体扫除CAR-T治疗实体瘤障碍 与Carl June合作的Candel Therapeutics是一家开发新型病毒免疫疗法的临床阶段生物制药公司，专注于通过引发系统性抗肿瘤免疫反应的病毒免疫疗法帮助患者对抗癌症（图5）。Candel的工程病毒旨在通过直接病毒介导的癌细胞细胞毒性诱导免疫原性细胞死亡，从而释放肿瘤新抗原，同时在注射部位创造促炎微环境。 Candel分别基于新型的转基因腺病毒和单纯疱疹病毒基因构建体，建立了两个临床阶段病毒免疫治疗平台（图6）。CAN-2409是腺病毒平台的主要候选产品，针对脑癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌。CAN-3110是HSV平台的主要候选产品，针对脑癌。enLIGHTEN™探索平台是第一个利用人类生物学和先进分析技术，为实体肿瘤创建新的病毒免疫疗法的基于HSV的系统迭代发现平台。 enLIGHTEN™平台生产基因工程HSV载体，可传递基因有效载荷，导致肿瘤细胞死亡或增强人体先天性和适应性抗癌免疫反应。Candel将其载体直接注射到肿瘤或周围组织中，以避免全身副作用。CAN-3110是一种基于HSV的治疗方法，其设计使关键的病毒复制基因置于肿瘤特异性启动子的控制之下。尽管存在整体抑制环境，这些修饰使CAN-3110能够在肿瘤细胞内积极且特异性地复制。在动物模型中，这种作用会产生很强的溶瘤细胞活性（图7）。 Candel的研究表明HSV比腺病毒等溶瘤病毒更有效，它们可以更好地保留在肿瘤部位，从而提高CAR-T细胞活性。HSV还具有更大的DNA容量，意味着可以将多个基因插入同一个载体中。如果将它注射到特定的肿瘤中，就可以调节肿瘤微环境，让CAR-T细胞可以进入肿瘤。 Candel总裁兼首席执行官Paul Peter Tak博士解释了HSV-CAR-T与其他方法的主要区别：“其他方法要么专注于传递带有特定CAR-T细胞抗原的病毒，要么将CAR-T与全身性病毒结合起来，以广泛激活免疫细胞或靶向TME的单个元素。我们的创新方法能够在临床前环境中识别和测试最好的基因组合来武装载体。使用基于人类生物学的数据驱动方法来确定目标的优先级，并使用计算机模型来选择有效载荷的最佳组合，从而在迭代过程中降低研究药物的风险。” 此外，谈到与Carl June的合作，Tak表示：“在过去的两年里，我们悄悄地完成了前期工作，并取得满意结果。宾夕法尼亚大学是CAR-T细胞开发的世界领先者，通过与宾夕法尼亚大学合作，我们将向世界展示我们一直在做的事情。基于技术的灵活性，以及计划治疗的疾病严重程度，我相信如果从科学的角度进展顺利，这将是一条相对较快的发展道路。我认为从综合能力来说，没有人可以比Candel能够更快地在这个领域行动。”
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