在一项新的研究中，来自俄罗斯科学院、俄罗斯国家研究中心分子遗传学研究所和斯科尔科沃科学技术研究院等研究机构的研究人员描述了两种新的紧凑的Cas9核酸酶，即CRISPR-Cas系统具有切割活性的组分，这将有可能扩大Cas9工具箱在基因组编辑中的应用。这两种Cas9核酸酶中的一种被证实可以在人类细胞中发挥作用，因而可用于生物医学应用。相关研究结果发表在2020年12月2日的Nucleic Acids Research期刊上，论文标题为“PpCas9 from Pasteurella pneumotropica — a compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells”。论文通讯作者为俄罗斯国家研究中心分子遗传学研究所的Konstantin Severinov博士。
CRISPR-Cas是借用细菌的基因组编辑技术，它依赖于Cas核酸酶；这些酶在CRISPR RNA的引导下，可以降解目标基因序列---它们是“基因剪刀”中的刀片。在研究应用中，最受欢迎的Cas9核酸酶是酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9，即II-A型SpCas9。它的效率很高，而且相对简单，这是因为一个较大的蛋白既能结合crRNA，又能切割DNA；它还需要一个短的PAM序列---一串位于在靶位点两端的核苷酸，以便SpCas9用来定位和“读取”它。
但是SpCas9是一个较大的蛋白，当人们想使用腺相关病毒（AAV）颗粒作为载体将这种“基因剪刀”递送到细胞中时，这就会产生问题。理想情况下，人们希望将编码这种Cas蛋白的基因和向导RNA（gRNA）序列都装入一种病毒颗粒中，而这种尺寸限制需要较短的Cas9种类。然而，那些较短的核酸酶往往需要更长、更复杂的PAM，因此科学家们面临着蛋白大小和靶标选择之间的权衡。
在这篇论文中，最近通过斯科尔科沃科学技术研究院博士答辩的Iana Fedorova以及Severinov实验室研究员Aleksandra Vasileva及其同事们描述了两种新的小型Cas9核酸酶：一种来自Defluviimonas sp.20V17（一种生活在热液喷口的细菌），即DfCas9，另一种来自侵肺巴斯德菌（Pasteurella pneumotropica，一种在啮齿动物和其他哺乳动物中发现的常见细菌），即PpCas9。这两种核酸酶恰好对AAV载体来说足够小，并且具有相对较短的PAM，对于Cas9核酸酶来说，这是“两全其美”的选择。
这两种新的Cas9核酸酶与II-C型CRISPR-Cas系统有关，与SpCas9相比，通常表现为更小的Cas9效应物。这两种核酸酶采用了类似于其他Cas9蛋白的保守的双叶结构，但也有独特的特点：它们缺乏几个插入子结构域，并且有一个较小的Wedge结构域（负责与单向导RNA支架相互作用的结构域，因而更加紧凑。
Fedorova说，“事实上，II-C型Cas9效应物往往需要较长的PAM序列，但这只是基于迄今描述的有限数量的II-C型Cas9效应物的观察。例如，最近发现的来自耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）的Cas9（SauriCas9），与PpCas9类似，需要短的PAM（5'-NNGG-3'）。很可能很快就会发现更多需要短PAM的II-C型Cas9酶。这些具有不同PAM要求的小型Cas9蛋白扩大了真核和原核基因组中潜在的可编辑DNA靶点的数量。”
体外研究和在细菌中的实验表明，这两种Cas9核酸酶能高效地切割DNA，而且PpCas9核酸酶在人体细胞中也很活跃。这些结果也发现它们与其他已被证明在真核细胞中起作用的Cas9核酸酶-- Nme1Cas9和Nme2Cas9---非常相似。虽然还需要开展更多的研究来确定这两种Cas9核酸酶的效率，但是这些研究人员认为它们可能为微生物工程和生物医学基因组编辑中使用的更传统的核酸酶提供了一种可行的替代物。
Fedorova指出，对PpCas9脱靶编辑（非预期修饰）的初步研究表明，这种酶具有合理的特异性。但要证实PpCas9的特异性足以被视为一种基因组编辑工具，还需要使用更复杂的方法进行额外的研究。
她补充道，“此外，看起来PpCas9在靶向细胞中的不同基因方面表现出选择性。这可能会减少PpCas9可能的基因组靶点的范围，这种偏好性是一个值得进一步研究的课题。”
