《广州健康院在猪体内再造出人体中期肾脏》

  • 来源专题:战略生物资源
  • 编译者: 李康音
  • 发布时间:2023-09-12
  •     2023年9月7日,中国科学院广州生物医药与健康研究院在《细胞-干细胞》(Cell Stem Cell)上以“Generation of a humanized mesonephros in pigs from induced pluripotent stem cells via embryo complementation”为题发表了封面研究论文,报道了利用胚胎补偿技术在猪体内成功再造人源中肾的策略。该研究利用具有高分化潜能、强竞争及抗凋亡能力的新型人诱导多能干细胞,结合优化的胚胎补偿技术体系,在肾脏缺陷猪模型体内实现了人源化中肾的异种体内再生,这是迄今世界范围内首次报道的人源化器官异种体内再生案例。

        该研究严格遵守相关伦理规定以及国际惯例,在3-4周胎龄内终止了妊娠。研究共获得2只胎龄25天,3只胎龄28天的中肾嵌合胎儿。这些嵌合胎儿的中肾内人源细胞占比最高可达70%,而人源细胞参与形成的中肾小管所占比例最高可达58%。针对肾脏发育关键功能性基因SIX1、SALL1、PAX2及WT1的免疫荧光染色结果证明,人源供体细胞已分化成为表达这些基因的功能性细胞,说明伴随着胚胎发育,肾脏缺陷猪胎儿体内的人源供体细胞将能够支持人源化肾脏生成。这一成果首次证明了基于干细胞及胚胎补偿技术在异种大动物体内再造人源化实质器官的可行性,为利用器官缺陷大动物模型进行器官异种体内再生迈出了关键一步,对解决供体器官严重短缺难题具有重要意义。




    编译来源:https://www.cas.cn/syky/202309/t20230909_4969900.shtml

  • 原文来源:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1934590923002862?via%3Dihub=
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    •  器官移植已成为多种终末期疾病的唯一有效治疗手段,供体器官严重缺乏却限制了这一疗法在临床上广泛应用。据不完全统计,我国每年开展器官移植手术的患者2万多例,而因终末期器官功能衰竭等待移植的患者高达30万,供需缺口巨大。基于干细胞的器官异种动物体内再生将是未来解决这一问题的理想途径。通过该途径获得的人源化器官不仅将具有更全面的细胞类型和更完善的器官结构与功能,而且由于供体细胞来源于患者自体,将有效避免异种器官或同种异体器官移植中存在的免疫排斥等问题。   9月7日,中国科学院广州生物医药与健康研究院在国际权威学术期刊Cell Stem Cell(《细胞干细胞》)发表封面研究论文,报道了利用胚胎补偿技术在猪体内成功再造人源中肾的策略。   在研究中,研究人员利用具有高分化潜能、强竞争及抗凋亡能力的新型人诱导多能干细胞,结合优化的胚胎补偿技术体系,在肾脏缺陷猪模型体内实现了人源化中肾的异种体内再生,这是世界范围内首次报道的人源化器官异种体内再生案例。   基于胚胎补偿技术实现人源化器官异种体内再生存在诸多障碍,包括人源多能干细胞的分化能力不足,在异种动物胚胎内的生存能力低下、大动物模型提供的器官缺陷生态位难以形成、异种胚胎嵌合补偿技术体系不完善等,导致从猪体内培育人体器官的设想一直没有成功。   为了寻求突破点,中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组、潘光锦课题组以及Miguel A. Esteban课题组组成联合攻关团队,在中国科学院“器官重建与制造”战略性先导科技专项的支持下,围绕人体肾脏的异种再生这一世界难题开展了5年多的探索。   攻关团队对人-猪胚胎补偿技术体系进行了全方位的优化,最终确定了理想的胚胎补偿技术流程,即在桑葚到早期囊胚时期注射3-5个人源供体细胞,以构建嵌合胚胎,后者在等比例混合的胚胎培养基和干细胞培养基中培养24小时后,移植入发情周期同步的代孕猪,即可获得嵌合猪胎儿,最终成功实现了人源化中肾的异种体内再生。   该研究严格遵守相关伦理规定以及国际惯例,在3-4周胎龄内终止了妊娠。共获得2只胎龄25天,3只胎龄28天的中肾嵌合胎儿。这些嵌合胎儿的中肾内人源细胞占比最高可达70%,而人源细胞参与形成的中肾小管所占比例最高可达58%。针对肾脏发育关键功能性基因SIX1,SALL1,PAX2及WT1的免疫荧光染色结果证明,人源供体细胞已分化成为表达这些基因的功能性细胞,说明伴随着胚胎发育,肾脏缺陷猪胎儿体内的人源供体细胞将能够支持人源化肾脏生成。   这项成果首次证明了基于干细胞及胚胎补偿技术在异种大动物体内再造人源化实质器官的可行性,为利用器官缺陷大动物模型进行器官异种体内再生迈出了关键的一步,对解决供体器官严重短缺难题具有重要意义。   中国科学院广州生物医药与健康研究院博士后王教伟、谢文广,副研究员栗楠、李文娟以及博士研究生张智帅为该论文的共同第一作者。中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员、戴祯研究员、Miguel A. Esteban研究员以及潘光锦研究员为本论文的共同通讯作者。项目受到中国科学院战略性先导科技专项、国家重点研发计划等基金的资助。
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    •  近日,中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组在Science China Life Sciences在线发表了题为Double knock-in pig models with elements of binary Tet-On and phiC31 integrase systems for controllable and switchable gene expression的研究论文,这项研究成功建立了仅需一轮体细胞克隆,即可获得可稳定遗传的药物调控外源基因表达的工具猪模型。   高表达外源基因的基因修饰猪在生物医药和农业领域具有重要的研究和应用价值。在猪体内引入可诱导基因表达系统,可以对外源基因表达进行精准的时空调控,有利于基因功能的深入剖析和拓展基因修饰猪的应用范围。长期以来,由于技术困难,稳定、高效的可诱导表达外源基因工具猪模型一直未能建立。随着基因编辑技术的快速发展,高效构建各种类型的基因突变,包括单基因敲入、单或多基因敲除/点突变的基因修饰猪模型成为可能,这为在猪上构建稳定可靠的可诱导基因表达体系提供了技术保障。   在研究过程中,该团队首先采用双位点定点敲入的策略,借助两种不同的抗性基因表达盒进行细胞筛选之后,结合体细胞克隆获得了四环素(Dox)诱导报告基因表达的工具猪模型。   为了提高后续获得Dox诱导其它基因表达猪模型的效率,在报告基因两侧引入了能被PhiC31重组酶识别的attP位点。在细胞以及克隆胚胎水平均能实现PhiC31介导的基因表达盒式置换,获得Dox诱导其它任意基因的基因修饰猪细胞,由此绕过复杂而又低效的传统基因敲入步骤。据此,该团队建立了过表达EGFP、hKRASG12D及OSKM的猪细胞系。   原癌基因KRASG12D突变是肿瘤病人中最常见的突变类型之一,条件性表达KRASG12D的动物模型在肿瘤研究中占有重要的作用。利用前述Dox诱导基因表达猪模型,该团队进一步建立了Dox诱导hKRASG12D(DIK)表达的猪品系。对从DIK猪分离获得的耳朵成纤维细胞及胎儿成纤维细胞进行Dox诱导,发现诱导后成纤维细胞具有更强的增殖能力,提示了其转化成肿瘤细胞的潜力。接着对7月龄的DIK猪进行长期的体内Dox诱导实验,在诱导后第8个月左右,DIK猪鼻子、口腔、阴囊部位出现肿瘤样增生,肿瘤样品表达鳞状细胞癌标志物CK5/6、CK18。进一步转录组测序分析表明,不同部位肿瘤样品间具有更相似的基因表达谱;GO分析富集到了细胞迁移、细胞运动、细胞粘附、细胞周期、细胞群体增殖和细胞通讯等生物过程;KEGG通路分析表明代谢及肿瘤等信号通路发生改变;Ras信号通路相关基因表达分析发现,许多活化Ras的下游效应蛋白,例如AFDN、PIK3CB、RASSF5、TIAM1、RIN1、RALBP1、RAPGEF5、PIK3R2和RALGDS均显著上调。综上,Dox诱导hKRASG12D表达可以驱动DIK猪体内肿瘤发生,DIK猪品系是肿瘤生物学研究的有力工具。   此外,可诱导表达外源基因工具猪,也是一种宝贵的基因资源,为后续建立各种用途的猪模型提供了极大便利。双位点敲入猪遵循孟德尔遗传定律,将Dox诱导报告基因表达猪与野生型猪交配扩繁,可获得四种不同基因型(Rosa26rtTA/WTHipp11TRE3G-tdTomato/WT, Rosa26WT/WTHipp11TRE3G-tdTomato/WT, Rosa26rtTA/WTHipp11WT/WT和Rosa26WT/WTHipp11WT/WT)后代。例如,对于Rosa26rtTA/WTHipp11TRE3G-tdTomato/WT基因型猪,可以将细胞水平的重组酶介导的基因盒式置换与体细胞核移植相结合,培育Dox诱导目的基因表达猪模型;鉴于体细胞核移植低效且昂贵,而基因盒式置换在胚胎中非常高效,因此,也可以采用将phiC31 mRNA和供体DNA直接注射到源自Dox诱导报告基因表达猪群的受精卵的方法培育Dox诱导目的基因表达猪;对于Rosa26WT/WTHipp11TRE3G-tdTomato/WT基因型猪,可以通过由组织特异性启动子控制的rtTA元件的单位点敲入,培育可用于谱系追踪的组织特异性诱导报告基因表达猪模型;类似地,对于Rosa26rtTA/WTHipp11WT/WT基因型,可以通过单位点敲入TRE3G驱动目的基因表达盒,培育Dox诱导表达猪品系。   本研究中,中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组金琴博士为第一作者,赖良学研究员和王可品副研究员为共同通讯作者。该研究成果得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省科技计划、海南省重大科技计划、中国科学院青年创新促进会和中国科协青年人才托举工程等项目的资助。