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《水稻遗传转化中的选择标记——植物磷酸甘露糖异构酶（PMI）》

  • 来源专题：转基因生物新品种培育
  • 编译者： 丁倩
  • 发布时间：2016-07-08

  • EcPMI基因被广泛用作基于植物遗传转化的甘露糖选择的选择标记基因（SMG）。虽然一些植物表现出显著的PMI活动，甚至在甘露糖敏感植物中发现活性PMI，但是植物PMI是否能用作SMG还尚不清楚。在本研究中，我们从小球藻和水稻中分离出四种新的PMI基因，评估了他们的体外同功酶活性，并与EcPMI的同功酶活性比较。活性的植物PMI作为SMG分别构建在双元载体中，然后通过土壤杆菌转入水稻。在籼稻和粳稻中，我们的研究结果表明通过与EcPMI相似的模式，植物PMI可以选择和产生转基因植物。转基因植物表现出植物PMI转录累积和体内PMI活性增强。此外，使用植物PMI作为SMG成功将感兴趣的基因转入水稻。因此，从植物中分离出甘露糖选择的新SMG，我们的分析表明，编码活性酶的PMI可能在植物共有，可能在同源转基因工程中被用作遗传成分。

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  • 《蛋白质印迹法检测转基因水稻的PMI蛋白》
    • 来源专题：转基因生物新品种培育
    • 编译者：丁倩
    • 发布时间：2016-06-28
    • 磷酸甘露糖异构酶（PMI）编码基因manA是转基因研究中理想的选择标记。了解其在转基因植物中的表达模式与建立基于免疫分析的高度敏感检测方法都对PMI的应用有重要意义。在本研究中，PMI的特性单克隆抗体利用重组蛋白作为免疫原产生，并可用于蛋白质印迹法检测低至0.5 ng标记PMI蛋白或占单粒稻米（约0.08毫克）0.4%的样本稻米的PMI蛋白表达。在水稻生长中的所有发育阶段，在包括根、茎、叶、穗和种子的许多测试组织中检测到由CaMV-35S驱动的PMI蛋白，幼苗阶段PMI蛋白约占叶子总蛋白量的0.036%。本文中建立的方法或可用于监测稻粒中的PMI蛋白。
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  • 《转基因植物新材料育种价值评估》
    • 来源专题：转基因生物新品种培育
    • 编译者：zhangyi8606
    • 发布时间：2020-10-11
    • 作者：姜奇彦 胡正 孙现军 张辉 （中国农业科学院作物科学研究所） 引言 当前，以转基因育种为代表的生物育种技术发展迅猛，正在推动常规育种全面升级，引领育种产业发生重大变革。从研发进展来看，从基因克隆到新品种培育就像一个金字塔，众多实验室开展了基因克隆、功能分析及优异基因挖掘的研究工作，组成了转基因育种的重要基石。优异基因的遗传转化、转基因材料的创制和目标性状的功能效率评价，作为转基因育种的一个重要阶段承上启下。之后优异的转基因材料从实验室走向田间，完成小、中、大规模的中间试验、环境释放、生产性试验阶段，经受住严格的安全性评价，包括食品安全和环境安全，然后才可以申报安全证书。走到这一阶段的材料可以说是凤毛麟角了。但随着我国转基因研究成果的不断涌现，取得生物安全证书后的转基因植物是否可以作为种质资源利用，进入育种程序，它们的育种利用价值如何，还需要深入评估，才可以不断缩小克隆的基因与育种利用之间的差距，加速转基因作物新品种培育的育种进程。 顾名思义，育种价值评估就是对转基因材料进行育种利用价值进行评估，具体包括功能基因知识产权分析，育种利用价值评估，以及转基因新材料保存及育种价值评估信息管理等几个方面。 功能基因知识产权分析 转基因新材料育种价值评估和知识产权分析有什么关系呢？在世界各国加快培育生物产业、抢占生物经济发展先机的激烈竞争中，知识产权成为占领生物技术制高点，圈占世界生物遗传资源的有力工具。据不完全统计，主要发达国家和国际生物技术公司在农业生物技术领域部署的专利、品种权等知识产权数量估计在30万件以上。与跨国种业巨头相比，国内研究机构在知识产权拥有量，特别是核心功能基因的专利数量与质量上还存在较大差距，很容易陷入跨国公司的知识产权陷阱，从粮种源头丧失保障国家粮食安全的能力。面对发达国家远谋深虑的知识产权布阵设防，必须对我国重要性状基因的知识产权进行科学系统的分析，通过掌握这些重要功能基因在全球知识产权保护的范围、重点及趋势，设计出我国转基因农作物新品种培育、转基因育种成果产业化的合理发展路径，才能有效突破发达国家的专利封锁与围剿，培育出具有自主知识产权的功能基因和生物新品种，这样的转基因新材料才具有更高的自主创新性和更大的育种利用价值。 知识产权的分析包括很多方面，如转基因技术，克隆的基因，甚至包括转基因过程中用到的一些载体、菌株、启动子等。主要通过专利广泛检索获取原始数据，然后进行数据处理、分析和解读，进行知识产权分析，最终为我国的转基因事件提出规避专利纠纷的建议策略。如日本烟草公司（Japan Tobacco INC）建立的农杆菌介导的小麦遗传转化新技术的转化效率高达40%，给小麦功能基因的研究带来了革命性的发展机遇。如果使用该技术，需要从日本烟草公司购买该项专利技术的使用权，并签订相关的规范性文件。而遗传转化过程中用到的载体如pCambia3301、菌株如LBA4404和ubiquitin启动子都是在生物学研究常用的，不受专利保护。采用具有独立自主知识产权的愈伤组织特异性表达的启动子CP代替35S/Ubi来启动选择性标记基因的表达，可以回避因Monsanto公司持有35S启动子而可能产生的专利权纠纷。 转基因植物新材料育种价值评估 转基因生物育种是一项系统科学工程，包含基因克隆、遗传转化、转基因材料创制、新品种培育、产业化推广应用等环节。例如在杜邦先锋种业公司，将转基因生物技术发展归纳为七个阶段（A到G），包含A（New ideas）、B（Evaluate genetic approaches）、C（Optimize gene construct）、D（Create commercial event）、E（Commercial event to regulatory）、F（Breeding and testing）、G（Sell product），其中将E具有育种利用价值的“最佳转化事件”定为最重要的阶段。在我国也在不断加强基因和育种材料的利用价值评估工作，目的是筛选具有重要应用前景的基因和材料，并快速应用于新品种研发。 转基因植物新材料的育种价值评估主要针对目标性状，如抗病虫、抗逆、高产、优质等等。首先明确目标性状的鉴定技术，制定或完善转基因植物目标性状鉴定技术规范或技术标准，利用这些规范或标准对转基因植物新材料的育种利用价值开展综合评估，最终筛选出有重大育种价值的基因和转基因作物育种新材料，应用于转基因生物育种。 对于重大育种价值基因针对不同性状，我国也有初步的判定标准。总体来讲，转基因或分子标记辅助育种研究结果表明重大育种价值基因应该对目标生物的重要经济性状具有显著改良效果，但对其他性状无不良影响。具体举例来讲，如抗棉铃虫性状，参考国家现有棉铃虫抗性标准，抗性达1级以上；如小麦各类抗病性状，抗性达1级以上；如植物抗逆性状，在半致死剂量逆境条件下，与对照相比，转基因作物存活率提高10%以上；在正常环境下，对作物生长发育没有显著负面影响；抗除草剂性状，抗草甘瞵EPSP合酶基因，可以耐受4倍生产上使用剂量的草甘膦，抗草甘瞵N-乙酰转移酶基因，可以耐受4倍生产上使用剂量的草甘膦；作物高产性状，通过转基因或分子标记辅助选择在作物中进行了基因功能验证，提高作物产量5%以上；作物品质性状，极显著改进外观品质，如籽粒外观、加工品质、食味、营养价值等性状，极显著改进度量品质，如纤维长度、强度、细度；作物蛋白质、淀粉、油分、油酸和不饱和脂肪酸、赖氨酸、含硫氨基酸等性状，性状值提高5%以上。养分高效性状，能明显提高养分的吸收或利用效率，与对照相比，在产量不变的前提下，能减少5%-10%氮、磷或钾肥的用量，或在同等施肥条件下，产量比对照提高5%以上；光能高效性状，能明显提高目标作物的光能吸收或利用效率，与对照相比，光能利用效率或抗光氧化能力提高5%以上，或生物量/产量比对照提高5%以上。 对于转基因育种新材料需要具备目标性状表现突出、重要经济性状表现稳定的特点。举例来讲，抗白叶枯病转基因水稻，抗白叶枯病效果达到高抗。鉴定标准参照国际水稻研究所9级分级标准。耐盐转基因水稻，耐盐效果达到中抗以上，鉴定标准参照国际水稻研究所制定的9级分级标准制定。高产转基因水稻，与受体对照品种比较，产量增加10%以上；与区试对照品种比较，产量增加5%以上。抗逆转基因小麦，抗旱性达到极强或强水平，鉴定方法参照2008年农业部颁布实施的“小麦抗旱性鉴定评价技术规范”（GB/T 21127—2007）。高产转基因玉米，东北春玉米区，与受体对照品种比较，产量增加8%以上，与区试对照品种比较，产量增加6%以上；黄淮海夏玉米区，与受体对照品种比较，产量增加5%以上，与区试对照品种比较，产量增加3%以上；西南山地玉米区：与受体对照品种比较，产量增加10%以上；与区试对照品种比较，产量增加5%以上。针对不同的作物，不同的性状，都有各自初步的判定标准。 转基因新材料保存及育种价值评估信息管理 完成了对自主创新的新基因或转基因新材料的目标性状的评价似乎就完成了转基因作物育种价值评估过程。但从长远来讲，这些新材料的保存及信息、材料的共享利用，对于转基因材料在作物育种中的安全、广泛应用也很重要。 我国已建立了国家农作物种质资源库和保存中心，长期保存各类农作物基因资源39万余份，建立了农作物基因资源信息系统和农作物基因资源共享平台。国家种质库未针对转基因材料建立专门的保存设施，尚无转基因材料保存的相关技术标准，在保存手段上相对单一，不能较好地满足转基因材料的保存需求；现有的基因资源信息系统也未制定基因和转基因材料的相关数据标准，转基因材料的信息尚未进入基因信息数据库中，基因和转基因材料的信息，尤其是育种价值评估信息的共享几乎是空白，严重影响了转基因材料的深入和持续利用。许多转基因新材料未纳入国家种质资源保存体系，导致转基因材料分散于各研究单位或专家手中，不利于转基因材料的长期保存和利用，也容易引起潜在的基因污染。因此，迫切需要在国家农作物种质资源库的基础上建立转基因材料的国家管理和保存体系，对转基因材料进行集中编目、接收、检测、保存和分发利用，并建立基因和转基因新材料的数据库，开发信息管理系统，实施跟踪管理，并实现新材料与信息的社会共享。对转基因作物育种价值评估的范畴也应该包括对转基因材料保存的安全性、基因和转基因信息数据库的完善度、信息及材料共享利用的可行性等进行评估，为转基因材料在作物育种中的安全、广泛应用提供重要的保障。 当然，随着各种类型的转基因新材料的不断涌现，转基因新材料在作物育种应用中各种新问题的出现，以及育种家对转基因新材料应用的各种新要求的提出等，对转基因植物育种价值评估的内容及标准也会不断完善和更新，确保转基因新材料在未来转基因生物育种中发挥更重要的作用。
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