在新冠疫情推动mRNA疫苗取得重大突破前，数百位科学家已经默默耕耘了几十年。1987年底，Robert Malone做了一个载入史册的实验。他用信使RNA（messenger RNA，mRNA）链和脂滴做了一道“分子乱炖”，这道基因乱炖里的人体细胞吸收了mRNA，并开始用其合成蛋白[1]。
Malone当时是美国加州索尔克生物研究所的研究生，他知道眼前的这一切会对医学产生深远影响，于是做了些笔记，并签上了名字和日期。他在1988年1月11日的笔记上写道，如果细胞能用被递送到其内部的mRNA合成蛋白，“RNA就能成为一种药物”。索尔克实验室的另一名成员也在笔记上签了名，以备后用。那年末，Malone用实验证明了青蛙胚胎也能吸收这些mRNA[2]。这是第一次有人用脂滴帮助mRNA顺利进入一种活生物。在这些实验的基础上，诞生了历史上最重要也最赚钱的疫苗：已在全世界接种数亿剂的新冠mRNA疫苗（参见：快如闪电！新冠疫苗的研发速度是如何实现的？）。仅2021年一年，其全球销量就能达到500亿美元。当然，成功的道路并非一帆风顺。Malone的实验离不开前人的工作，而在Malone实验之后的很多年里，mRNA被认为作为药物或疫苗都太不稳定，而且太贵。数十家研究实验室和公司尝试了这个想法，但都无法找到脂质与核酸的完美配比——核酸是mRNA疫苗的基本成分。
今天mRNA疫苗使用的很多新技术都是在Malone研究时期的多年后发明出来的，包括经过化学修饰的RNA和帮助这些RNA进入细胞的不同脂滴类型（见“新冠mRNA疫苗的内部”）。不过，自诩“mRNA疫苗发明者”的Malone依然认为自己的贡献被忽略了。他对《自然》表示，“历史把我遗忘了。”一向只颁给少数几位科学家的权威奖项难免会漏掉mRNA医学发展史上的诸多贡献者。其实，mRNA疫苗的成功离不开数百位研究人员在30多年里的辛勤付出。这也反映出科学发现是如何一步步成为改变人类生活的重大突破：几十年看不到曙光、各种拒绝、对潜在利益的你争我夺；当然也有源源不断的好奇心和面对质疑初心不改的豪情。“这是很长的一串脚印。你永远不知道哪些东西将来会大派用场。”美国亚利桑那州大学发育生物学家Paul Krieg说。Krieg在80年代中期也做出了自己的贡献。
mRNA的缘起
Malone的实验想法绝非凭空而来。早在1978年，就有科学家用名为脂质体的脂质膜结构将mRNA转运到小鼠[3]和人类[4]细胞内诱导蛋白质表达。这种脂质体能包裹并保护mRNA，之后与细胞膜融合，将这种遗传物质送入细胞。这些实验建立在对脂质体和mRNA的多年研究之上；脂质体和mRNA都是在60年代发现的（见“mRNA疫苗的历史”）。但在当时，研究人员还没有把mRNA当作医疗产品看待，尤其是在实验室合成这种遗传物质的方式还没出现的情况下。他们其实希望用mRNA来研究基础的分子过程。大部分研究人员只能想办法使用来自兔子血细胞、培养的小鼠细胞或一些其他动物来源的mRNA。
事情在1984年出现了转机。当时，Krieg和哈佛大学发育生物学家Douglas Melton以及分子生物学家Tom Maniatis和Michael Green领导的一个团队合作，他们利用一种RNA合成酶（取自一种病毒）和其他工具在实验室得到了具有生物活性的mRNA[5]——这项技术的核心沿用至今。之后，Krieg将实验室合成的mRNA注射到青蛙卵子中，证明它和真的没两样[6]。Melton和Krieg说，他们主要把合成mRNA当作研究基因功能和活性的工具。1987年，就在Melton发现这种合成mRNA能激活或抑制蛋白产生之后，他参与创立了一家名为Oligogen的公司[后更名为吉利德科学公司（Gilead Sciences），总部在加州福斯特城]，专门研究合成RNA抑制目标基因表达的方法，寻找治病的可能。但在他的实验室或合作者中，没有人想到疫苗。
“众所周知，RNA极不稳定，”Krieg说，“关于RNA的一切都要非常小心。”这或许解释了哈佛大学的技术研发部为何不给该团队的RNA合成技术申报专利。于是，该团队只能把他们的试剂让给威斯康星州麦迪逊的一家实验用品公司Promega Corporation，这家公司专为研究人员提供RNA合成工具。作为回报，团队得到了一笔不多不少的专利使用费和一箱凯歌香槟。
专利之争
多年后，Malone在自己的实验中使用了哈佛团队合成mRNA的方法。但他添加了一种新的脂质体，这种脂质体带一个正电荷，能增强它与mRNA带负电的骨架的结合。这种脂质体由生物化学家Philip Felgner开发，他现在是加州大学欧文分校疫苗研发中心的主任。虽然Malone成功用这种脂质体将mRNA送入了人体细胞和青蛙胚胎，但他从来没有拿到过博士学位。1989年，Malone因为和索尔克研究所的导师、基因疗法研究员Inder Verma不咬弦，提前结束了研究生学习，来到加州的初创公司Vical替Felgner工作。在那里，他们与威斯康星大学麦迪逊分校的合作者证明了这种脂质-mRNA复合物可以促进小鼠体内的蛋白产生[7]。
事情从这里开始变得复杂了。Vical公司（联合威斯康星大学）和索尔克研究所都在1989年3月开始提交专利申请。但索尔克研究所很快放弃了申请，Verma则在1990年加入了Vical公司的顾问委员会。Malone称他的前导师Verma和Vical公司达成了一桩幕后交易，使得相关知识产权最后归Vical所有。Malone等人被列为发明人，但他本人不能从之后的许可协议中获利，而他本来可以从索尔克授权的专利中获利。Malone的结论是：“他们利用我的想法发了财。”Verma和Felgner断然否认了Malone的指控。“这简直就是无稽之谈。”Verma告诉《自然》，撤回专利申请是索尔克研究所技术转移处的决定。（由于被指控性骚扰，Verma在2018年从索尔克辞职，但他至今仍否认这些指控。）
Malone在1989年8月离开了Vical公司，理由是他与Felgner在 “科学判断上”以及在“对他本人的知识产权贡献上”存在分歧。他从医学院毕业后接受了一年的临床培训，后来进入了学术界，打算继续研究mRNA疫苗，但一直拿不到经费。（1996年，他向加州的一个州立研究机构申请研究经费，用于研究预防季节性冠状病毒感染的mRNA疫苗，但申请失败。）Malone只能转而研究DNA疫苗和递送技术。2001年，他转型从事商务和咨询工作。过去几个月里，他开始公开质疑以他早前研究为基础的mRNA疫苗的安全性。Malone说，疫苗产生的蛋白会损害人体细胞，而且疫苗的风险超过它对儿童和年轻人的益处——这种观点受到其他科学家和卫生专家的一再反驳。
生产难点
1991年，Vical 公司与大型疫苗生产商美国默克集团（Merck）达成了一项数百万美元的研究合作和许可协议。默克集团的科研人员用小鼠测试了这一mRNA技术，试图发明一款流感疫苗，但后来又放弃了。“生产成本和可行性迫使我们喊停。”前默克研究人员、如今为各大公司提供疫苗研发咨询的Jeffery Ulmer说。
法国斯特拉斯堡有一家小型生物技术公司，名为Transgène，那里的研究人员也有同样的感受。1993年，Pierre Meulien在该公司领导的一个团队与产业界和学术界合作，首次证明了包在脂质体中的mRNA能在小鼠体内诱导出一种特异性的抗病毒免疫应答[8]。[另一个激动人心的进展出现在1992年，当时美国斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的科学家用mRNA技术取代了大鼠体内缺少的一种蛋白，用来治疗代谢疾病[9]。但独立实验室又花了20年的时间才取得了类似的成功。]
Transgène公司的研究人员为他们的发明申请了专利，并继续研究mRNA疫苗。Meulien当时估计他至少需要1亿欧元（约1.19亿美元）来优化整个平台，但他说自己没打算为这个“高风险”的项目向他的老板要这么多钱。Meulien现在已经是Innovative Medicines Initiative的主管，这是一家位于布鲁塞尔的公私合营企业。由于Transgène的母公司决定不再续费，这个专利便失效了。
Meulien的团队和默克的团队一样，后来都去研究DNA疫苗和其他基于载体的递送系统了。DNA疫苗平台最终获得了一些兽医上的应用许可，比如用来预防养鱼场出现感染。就在上个月，印度的监管当局批准了全球首个供人类使用的新冠DNA疫苗（参见：印度将推出全球首个新冠DNA疫苗）。但是，DNA疫苗在人体上的进展一直很慢，个中原因迄今仍未得到完全理解。Ulmer认为，产业界在DNA技术上的发力也带动了RNA疫苗的进展，无论是生产和监管环节，还是序列设计和分子机制，“我们从DNA上学到的很多东西都可以直接用于RNA，”他说，“这为RNA的成功奠定了基础。”
持续挣扎
从1990年代到2000年代的大部分时期里，几乎每个想做mRNA的疫苗公司都把目光投向了别处。传统观点总是觉得mRNA太容易降解，生产成本太高。瑞典卡罗林斯卡医学院病毒学家Peter Liljestr?m说：“这是一场持续的挣扎。”Liljestr?m在30年前开创了一种“自扩增”的RNA疫苗。Matt Winkler说：“RNA用起来实在太难了。”Winkler于1989年在美国成立了最早专注于RNA的实验用品公司之一Ambion。“如果你当时问我是不是可以把RNA作为疫苗打到人体内，我肯定会当着你的面大笑。”
mRNA疫苗的概念在肿瘤界倒是颇受欢迎，但研究人员主要想用它来治疗疾病，而不是预防疾病。从基因治疗师David Curiel的工作开始，许多学术人员和初创公司都在研究mRNA是否能用来对付癌症。这里的思路是：如果mRNA能编码癌细胞表达的蛋白，那么把mRNA注射到体内就可以训练免疫系统去攻击这些细胞。目前就职于华盛顿大学医学院的Curiel在小鼠上成功了几次[10]。但是当他向Ambion公司阐述其中的商业机遇时，公司告诉他：“我们看不到这个技术的任何经济潜力。”相比之下，另一位癌症免疫学家取得了更多成功——1997年，全球第一家mRNA治疗公司由此诞生。Eli Gilboa的建议是从血液中获得免疫细胞，“唆使”它们吸收编码肿瘤蛋白的合成mRNA，再将这些细胞注射到体内，调动免疫系统攻击潜伏的肿瘤。
Gilboa和他在美国杜克大学医学院的同事在小鼠中演示了以上过程[11]。到90年代末，学术合作者已经启动了人体试验，Gilboa的商业衍生公司Merix Bioscience（后更名为Argos Therapeutics，现名为CoImmune）很快开展了自己的临床研究。整个技术看上去很有前景，但几年后，一个已经进入后期的候选疫苗在一次大规模试验中失败了，这类技术现在几乎已经很少有人关注。
虽然如此，Gilboa的工作还是产生了很重要的影响——这些工作让CureVac和BioNTech的创始人决定投身mRNA的研究——这两家德国公司现在已是全球领先的mRNA企业。CureVac的Ingmar Hoerr和BioNTech的U?ur ?ahin告诉《自然》，在了解到Gilboa的工作后，他们也想做此尝试，但是是通过把mRNA直接注射到体内的方式。“出现了雪球效应。”目前在迈阿密大学米勒医学院任职的Gilboa说。
创业加速器
Hoerr是第一个取得成功的。2000年，还在德国图宾根大学的他报道了直接注射也许能诱导小鼠体内的免疫应答[12]。他在那年创立了CureVac（也位于图宾根），但感兴趣的研究人员或投资人很少。Hoerr在一场学术会议上报告了一些早期小鼠数据，他说，“当时第一排的一位诺贝尔奖得主站起来说，‘你这些都是胡说八道，全是胡扯’。”（Hoerr拒绝透露这位诺贝尔奖得主是谁。）但慢慢地，资金开始源源不断地涌入，不到几年就开始了人体实验。该公司当时的首席科学官Steve Pascolo成了第一个实验对象：他给自己注射[13]了mRNA，现在腿部还有一个火柴头大小的白色伤疤，这是当时皮肤科医生为了做多点活检留下的。之后没多久，公司就启动了使用皮肤癌患者的肿瘤特异性mRNA的正规试验。
?ahin和他的免疫学家妻子?zlem Türeci也是在90年代末开始研究mRNA的，但成立公司的时间要比Hoerr晚。他们俩人在德国美因茨约翰内斯古滕贝格大学研究这项技术很多年，期间专利、论文、经费全部到位，并在2007年向一位亿万富翁投资人提交了一份商业计划书。?ahin 说：“如果能成功，将具有开拓意义。”后来，他拿到了1.5亿欧元的创业资金。同年，刚刚成立的mRNA公司RNARx得到了美国政府向小企业发放的一笔相对微薄的款项：97396美元。公司的两位创始人——生物化学家 Katalin Karikó和免疫学家Drew Weissman当时都供职于美国宾夕法尼亚大学（简称宾大），他们做出了现在一些人认为非常关键的发现：改变mRNA的部分密码子能帮助合成mRNA躲过细胞的固有免疫防御。
开拓性贡献
Karikó在整个90年代都在实验室埋头苦干，她的目标是让mRNA成为一个药物平台，但资助机构一再拒绝了她的经费申请。1995年，在经历多次挫败后，宾大要求她选择辞职或降职减薪。她最终选择了留下，继续追求她的目标，改进Malone的实验方法[14]，诱导细胞产生具有治疗相关性的较大复杂蛋白[15]。到了1997年，她开始与Weissman合作，Weissman此时刚在宾大成立了自己的实验室。两人计划一起开发针对HIV/AIDS的mRNA疫苗。不过，Karikó的mRNA在注射到小鼠体内时产生了很大的炎症反应。她和Weissman很快找到了原因：这种合成mRNA激活了[16]一连串名为Toll样受体的免疫传感器，这些受体能在第一时间对来自病原体的危险信号作出响应。2005年，两人发表论文指出，重新编排mRNA的一个核苷酸——尿苷——的化学键 ，就能创造出一种名为假尿苷的类似物，这种方法似乎能防止机体将合成mRNA视为敌人[17]。
那个时候，很少有科学家看到修饰核苷酸的治疗价值，但科学界很快就意识到了它们的潜力。2010年9月，波士顿儿童医院干细胞生物学家Derrick Rossi领导一个团队描述了如何用修饰的RNA改造皮肤细胞，先变成胚胎样干细胞，再变成收缩的肌肉组织[18]。研究结果引起了轰动，Rossi入选了《时代周刊》（Time）2010年“年度重要人物”并在坎布里奇市联合创立了Moderna公司。Moderna公司尝试获得宾大在2006年申请的Karikó和Weissman的修饰mRNA专利的许可，但晚了一步。在与RNARx达成许可协议未果后，宾大已于2010年2月向麦迪逊的一家小型实验试剂供应商授予了独家专利。如今名为Cellscript的这家供应商当时在协议中支付了30万美元，现在能从Moderna和BioNTech的转授许可费中获得数亿美元。Moderna和BioNTech是最先推出新冠mRNA疫苗的两家公司，它们的产品都含有修饰的mRNA。 与此同时，RNARx用光了另一笔总额80万美元的小企业资助款项，并在2013年停止经营，在这前后Karikó也加入了BioNTech（同时保留了她在宾大的兼职）。
假尿苷之争
Karikó和Weissman的发现对mRNA疫苗的成功是否关键，研究人员对此争论不休。Moderna一直在使用修饰的mRNA，其公司名本身就是这两个词的组合。其他一些公司则不然。马萨诸塞州制药公司Shire的人类遗传学疗法部研究人员给出的理由是，只要添加正确的“帽”结构并清除所有杂质，未修饰的mRNA也能成为一种效果类似的产品。“归根结底还是要看RNA的质量。”Michael Heartlein说。Heartlein在Shire负责领导科研工作，日后在Translate Bio继续推进这项技术——Shire后来把它的mRNA产品线出售给了Translate Bio。（Shire现在属于日本的武田制药。）
虽然Translate公司的一些人体数据显示，其mRNA不会诱导危险的免疫应答，但它的平台依然需要接受临床验证：它的候选新冠疫苗仍处于人体试验初期。但法国制药巨头赛诺菲（Sanofi）很看好该技术的前景：2021年8月，赛诺菲宣布计划以32亿美元收购Translate。（Heartlein去年另起炉灶，在马萨诸塞州创建了一家名为Maritime Therapeutics的公司。）与此同时，CureVac公司也为缓解免疫应答提出了自己的策略，该策略需要改变mRNA的基因序列，将其疫苗中的尿苷减至最少。二十年的辛苦耕耘似乎终于有了收获，该公司的狂犬病[19]和COVID-19[20]实验性疫苗都在早期试验中表现不俗。
但在6月，后期的试验数据显示，CureVac的候选新冠疫苗在保护效力上不如Moderna或BioNTech的疫苗。看到这些结果，一些mRNA专家现在相信，假尿苷是这项技术中不可或缺的元素，他们说，Karikó和Weissman的发现是值得认可和嘉奖的主要贡献之一。“真正的获奖者应该是修饰的RNA。”专注于mRNA疗法的合成生物学公司Strand Therapeutics的联合创始人、首席执行官Jake Becraft说。但也不是人人都这么肯定。“可能影响mRNA疫苗安全性和效力的因素有很多，mRNA的化学修饰只是其中之一。”苏州艾博生物科技有限公司首席执行官英博说。这家中国公司的新冠mRNA疫苗已进入临床后期。（产品名为ARCoV，使用的是未修饰的mRNA。）
脂质突破
说到关键技术，许多专家还提到了对mRNA疫苗至关重要的另一项创新成果——这次和mRNA没有任何关系。它就是脂质纳米粒（LNP），这种微小脂滴能保护mRNA并将其送入细胞。这项技术来自Pieter Cullis的实验室和他创立或管理的多家公司。Cullis是加拿大不列颠哥伦比亚大学的生物化学家。90年代末起，他的实验室和公司便首创将LNP用于递送能让基因失去活性的核酸链。其中一种药物叫patisiran，现已被批准用于治疗一种罕见遗传病。
之后，基因沉默疗法逐渐在临床试验中显示出效果，2012年，Cullis的两家公司开始转型，探索LNP递送系统在基于mRNA的药物中的应用前景。比如温哥华的Acuitas Therapeutics公司在首席执行官Thomas Madden的领导下与Weissman在宾大的团队以及多家mRNA公司合作，共同测试mRNA-LNP的不同配比。其中一个配比已经被BioNTech和CureVac的新冠疫苗所使用。Moderna的LNP复合物也与此相差无几。
这种纳米粒含有四种脂质分子：三个分子决定结构和稳定性；第四个名为可电离脂质的分子是LNP有效的关键。这种物质在实验条件下带正电，与Felgner开发的、Malone在80年代末测试的脂质体具有类似优势。但Cullis和商业伙伴开发的可电离脂质能在生理条件下（如在血液中）变成中性，这样能减少对人体的毒性。此外，混合四种脂质能让产品的保质期更长，在体内的稳定性更好，在Cullis管理的多家公司担任前高管的Ian MacLachlan说，“我们现在的药理学是建立在所有这一切的基础之上的。”
到了2000年代中期，研究人员想出了一种混合和生产这些纳米粒的新方法，需要用到名为T-connector的装置将脂肪（溶解在酒精中）与核酸（溶解在酸缓冲液中）结合。当两种溶液混合时，这些成分会自发形成紧密的LNP[21]。这种方法已被证明比生产基于mRNA的药物的其他方式更可靠。
一旦将所有碎片拼接起来，“就像是天呐，我们终于有一个可以规模化的生产流程了。”目前在圣迭戈Replicate Bioscience公司担任首席发展官的Andrew Geall说。2012年，Geall带领首支团队在诺华（Novartis）美国分部成功结合了LNP与RNA疫苗[22]。所有mRNA公司现在都在用类似这种LNP递送平台和生产系统，但相关专利的归属权仍深陷法律纠纷。比如Moderna就与Cullis的一家公司——温哥华的Arbutus Biopharma——对簿公堂：Moderna新冠疫苗使用的LNP技术到底是谁的专利？
一个产业的诞生
到了2000年代末，多家大型药企都开始向mRNA进军。2008年，诺华和Shire都成立了mRNA研发部门——前者（由Geall领导）关注疫苗，后者（由Heartlein领导）关注药物。BioNTech便在那年成立，其他初创公司也纷纷入局，这是因为美国国防部高级研究计划局（DARPA）在2012年决定资助产业界研究RNA疫苗和药物。Moderna便是在此基础上壮大的公司之一——2015年已经筹资超过10亿美元，其目标是利用mRNA诱导体内细胞产生自己的药物，治疗因蛋白缺失或失效导致的疾病。当这个计划落空时，Moderna在其首席执行官Stéphane Bancel的领导下只能选择一个更小的目标：做疫苗。
一开始，许多投资者和观望者都非常失望，因为疫苗平台的颠覆性和盈利性看起来都要逊色不少。截至2020年初，Moderna共有9种针对传染病的候选mRNA疫苗进入了人体测试，但没有一个大获全胜。只有一个候选疫苗进入了更大规模的试验。 面对突如其来的COVID-19，Moderna火速行动，在新冠病毒基因组序列公开后的几天内就做好了一个原型疫苗。Moderna后来与美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）合作开展小鼠研究和人体试验，这一切只用了不到10周。BioNTech这边也是全员出动。2020年3月，BioNTech与纽约制药公司辉瑞（Pfizer）合作，在不到8个月的时间里破纪录地走完了从首次人体试验到紧急使用批准的流程。这两款获得授权的疫苗都使用修饰的mRNA加入LNP，而且所含序列编码的新冠病毒刺突蛋白的形状更易诱导保护性免疫。许多专家表示，由NIAID疫苗学家Barney Graham、得克萨斯大学奥斯汀分校结构生物学家Jason McLellan，以及斯克里普斯研究所的Andrew Ward设计的这种对蛋白质形状的调整也是一个可以拿奖的成就，虽然这只针对新冠病毒疫苗，不适合所有mRNA疫苗。 围绕mRNA贡献的争论，一些争议涉及谁才拥有最赚钱的专利。但是，许多奠基性的知识产权都要追溯到Felgner、Malone和他们在Vical公司的同事在1989年（以及Liljestrom在1990年）提出的观点。这些产权从授权日起只有17年的有效期，所以现在已经不再受到专利权限制。即使是Karikó和Weissman的专利也将在5年后过期，该专利在2006年申请，后来授权给了Cellscript公司。产业界知情人士表示，这意味着在脂质纳米粒中递送mRNA的宽泛概念很快也将难以申请专利了，但各家公司可以合理地对特定的mRNA序列申请专利，比如某种刺突蛋白的形式，或是专有的脂质配比。各个公司已经在行动了。Moderna作为mRNA疫苗领域的主要入局者，其在流感、巨细胞病毒和一系列其他传染病上的实验性疫苗已经开展了临床试验，它在去年获得了两个专利，范围涵盖广泛使用mRNA产生分泌蛋白（参见：RNA疫苗如何在新冠疫情中弯道超车？）。但有多位产业界知情人士告诉《自然》，他们认为这两个专利可能会出现纠纷。“我们感觉可申请的专利不多了。”加拿大mRNA疫苗公司 Providence Therapeutics的首席科学官Eric Marcusson说。
回顾过去，许多参与者都表示很高兴mRNA疫苗能给人类带来改变，以及自己有幸做出了有价值的贡献。“见证这一切令我无比激动，”Felgner说，“我们那时坚信会发生的所有事现在都发生了。”
本文内容转载自“ Nature Portfolio”微信公众号。
原文链接:https://mp.weixin.qq.com/s/IYAFjB2QjFpVB13Z0bPqew
