近年来，肿瘤疫苗逐渐成为重要的免疫疗法之一，而其中的原位疫苗（ISV）也有着越来越广泛的应用。ISV直接作用于肿瘤部位，发挥免疫刺激作用，招募免疫细胞至肿瘤部位，促进肿瘤抗原呈递，甚至可以引发全身性的抗肿瘤免疫反应[1]。
然而，由于免疫抑制性肿瘤微环境的存在，免疫效应细胞难以浸润，单独使用ISV的疗效并不理想，不足以根除肿瘤，也较少激发全身性的抗肿瘤免疫反应。如何将ISV与其他免疫疗法联合，引发局部和系统的抗肿瘤免疫反应，也是研究人员关注的热点问题。
近日，由达特茅斯学院的Steven Fiering领衔的研究团队。在《癌症免疫治疗》杂志发表重要研究成果[2]。
他们发现，将豇豆花叶病毒（CPMV）作为ISV治疗肿瘤，可以在部分肿瘤模型中引发T淋巴细胞及树突状细胞依赖性的抗肿瘤免疫反应。当CPMV与抗CD40抗体或抗PD-1抗体联合使用时，可以进一步诱导全身性抗肿瘤免疫反应，有效抑制肿瘤生长。
他们的研究证明，CPMV能够引发系统性抗肿瘤免疫反应，并且提供了一种新的联合治疗方式，即CPMV原位治疗+抗CD40抗体原位治疗+抗PD-1抗体。这种联合治疗方式有助于改善肿瘤微环境，加强抗原呈递，并克服肿瘤对于免疫检查点疗法的耐药性，诱导长效抗肿瘤作用。
CPMV是一种植物病毒，无法感染动物细胞，但其衣壳及单链RNA可作为Toll样受体（TLR）激动剂[3-4]，有效活化抗原呈递细胞，诱导细胞因子分泌，重塑肿瘤微环境。已有研究表明，CPMV可抑制小鼠肿瘤转移[5]以及犬类肿瘤生长[6]。
既然CPMV原位治疗能促进抗原呈递，引发抗肿瘤免疫反应，其激发系统性免疫反应的潜能如何呢？当其与免疫检查点疗法联合使用，能否针对不同癌症，实现强强联合的效果呢？
针对这些问题，研究人员展开了以下探索。
研究人员首先建立了不同的小鼠双侧肿瘤模型，包括小鼠黑色素瘤B16F10模型、结肠癌CT26和MC38模型，以及小鼠乳腺癌4T1肿瘤模型，并对荷瘤小鼠的一侧肿瘤给予两次CPMV原位治疗（瘤内注射）。在B16F10、CT26及MC38肿瘤模型中，双侧肿瘤生长均受到显著抑制，表明CPMV原位治疗带来了系统性的抗肿瘤免疫反应。而在免疫原性较差的4T1肿瘤中，双侧肿瘤生长均未受到抑制。
肿瘤疫苗作为免疫疗法的一种，其起效自然离不开免疫细胞的参与，接下来，研究人员探寻了CPMV原位治疗引发抗肿瘤免疫反应的机制。
研究人员发现，对于CPMV原位治疗有响应的B16F10荷瘤小鼠中，其肿瘤引流淋巴结内CD8+T淋巴细胞显著增多。而在缺乏T细胞和B细胞的Rag2-/-免疫缺陷小鼠中，CPMV原位治疗只能抑制治疗处的肿瘤生长，却无法抑制远端未治疗的肿瘤。当使用抗体去除荷瘤小鼠体内的CD8+T淋巴细胞，荷瘤小鼠也出现了类似的现象。
抗肿瘤免疫反应中，除了依赖于CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞进行攻击，抗原呈递细胞（APC）也是其中的重要一员。已经有研究表明，CPMV原位治疗的效果依赖于吞噬性的抗原呈递细胞[7]，这类细胞起着处理和递送抗原的关键作用。因此，研究人员也观察了CPMV原位治疗后抗原呈递细胞的变化。
流式细胞术分析表明，CPMV原位治疗后，小鼠肿瘤内的树突状细胞（DC），尤其是cDC1细胞占比显著增多。而且，在树突状细胞缺陷小鼠（Batf3-/-小鼠）中，CPMV原位治疗只能延缓治疗处的肿瘤生长，对远端未治疗肿瘤则失去抑制作用。以上数据表明，cDC1细胞参与了CPMV原位治疗引发的系统性抗肿瘤免疫反应。
上述实验已经表明，树突状细胞在CPMV原位治疗引发的抗肿瘤免疫反应中发挥了重要的作用。于是，研究人员假设，使用激动剂进一步活化树突状细胞，是不是能进一步提高CPMV的治疗效果，引发更强的抗肿瘤免疫反应呢？
研究人员分别建立了黑色素瘤B16F10和乳腺癌4T1肿瘤模型，并分别对小鼠进行CPMV原位治疗、抗CD40抗体原位治疗或二者的联合治疗。结果表明，接受联合治疗的肿瘤显著减小，且远端未接受治疗的肿瘤生长也明显延缓。值得一提的是，免疫原性较差的4T1肿瘤也对这一联合疗法产生响应，再次证明了该联合疗法的潜力。
可以说，CPMV联合抗CD40抗体原位治疗有一定效果，但是4T1肿瘤仍持续生长。因此，研究人员在此的基础上引入了抗PD-1抗体，期待能更大程度抑制肿瘤生长。令人欣喜的是，对于乳腺癌4T1肿瘤，三重联合疗法对于双侧肿瘤都有着更强的抑制作用。
免疫检查点疗法在临床治疗中往往表现出一定的耐药性，研究人员也探索了CPMV和抗CD40抗体联合原位治疗是否有助于克服肿瘤对免疫检查点疗法的耐药性。
使用四次三重联合疗法后，双侧B16F10肿瘤几乎全部消失，小鼠生存期显著延长，而4T1乳腺癌荷瘤小鼠生存期也有所改善。可以说，CPMV和抗CD40抗体联合原位治疗帮助克服了免疫检查点疗法的耐药性，带来了更加持久的抗肿瘤免疫效果。
总的来说，这项研究证明了CPMV作为一种原位肿瘤疫苗，有效刺激系统性抗肿瘤免疫反应。当其与树突状细胞激动剂抗CD40抗体联用，可以激活抗原呈递细胞，并改善了肿瘤微环境，促进了“冷”肿瘤对于抗PD-1抗体的响应，该三重联合疗法为肿瘤治疗提供了一种新的思路。
CPMV原位治疗具有一定的优越性：其使用剂量较低，制作过程简便快速，因此带来了更低的成本；此外，使用CPMV原位治疗，不需要识别和合成肿瘤特异性新抗原，在治疗过程中，肿瘤本身及其所含的任何可识别抗原，都可以被当作免疫系统攻击的“靶标”，以带来更强的抗肿瘤免疫反应。如果该策略安全有效地转化至临床使用，将为更多肿瘤患者带去希望。
参考文献:
1. Mao C, Gorbet MJ, Singh A, Ranjan A, Fiering S. In situ vaccination with nanoparticles for cancer immunotherapy: understanding the immunology. Int J Hyperthermia. 2020;37(3):4-17. doi:10.1080/02656736.2020.1810333
2. Mao C, Beiss V, Ho GW, Fields J, Steinmetz NF, Fiering S. In situ vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 2022;10(12):e005834. doi:10.1136/jitc-2022-005834
3. Mao C, Beiss V, Fields J, Steinmetz NF, Fiering S. Cowpea mosaic virus stimulates antitumor immunity through recognition by multiple MYD88-dependent toll-like receptors. Biomaterials. 2021;275:120914. doi:10.1016/j.biomaterials.2021.120914
4. Albakri MM, Veliz FA, Fiering SN, Steinmetz NF, Sieg SF. Endosomal toll-like receptors play a key role in activation of primary human monocytes by cowpea mosaic virus. Immunology. 2020;159(2):183-192. doi:10.1111/imm.13135
5. Lizotte PH, Wen AM, Sheen MR, et al. In situ vaccination with cowpea mosaic virus nanoparticles suppresses metastatic cancer. Nat Nanotechnol. 2016;11(3):295-303. doi:10.1038/nnano.2015.292
6. Alonso-Miguel D, Valdivia G, Guerrera D, et al. Neoadjuvant in situ vaccination with cowpea mosaic virus as a novel therapy against canine inflammatory mammary cancer. J Immunother Cancer. 2022;10(3):e004044. doi:10.1136/jitc-2021-004044
7. Wang C, Fiering SN, Steinmetz NF. Cowpea Mosaic Virus Promotes Anti-Tumor Activity and Immune Memory in a Mouse Ovarian Tumor Model. Adv Ther (Weinh). 2019;2(5):1900003. doi:10.1002/adtp.201900003
