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《分子细胞卓越中心等揭示线粒体tRNA选择性降解导致HUPRA综合征的分子机制》

  • 来源专题：转基因生物新品种培育
  • 编译者： 姜丽华
  • 发布时间：2022-12-07

  •   11月9日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）研究员周小龙团队与上海儿童医学中心研究员王剑团队合作以Selective degradation of tRNASer(AGY) is the primary driver for mitochondrial seryl-tRNA synthetase-related disease为题在Nucleic Acids Research上在线发表最新研究成果。

      哺乳动物细胞具有两套蛋白质合成系统，即细胞质与线粒体蛋白质合成系统。人线粒体基因组含有37个基因，包括2个rRNA

    (12S与16S)、22个tRNA以及13个蛋白质编码基因。线粒体翻译机器的所有核酸组分（mRNA、rRNA、tRNA）由线粒体基因组编码，所有的蛋白质组分由核基因编码，在细胞质中合成后，由线粒体定位信号肽转运至线粒体中发挥功能。线粒体蛋白质合成只生产13种线粒体基因组编码的蛋白质，它们都是线粒体氧化磷酸化复合物I、III、IV、V中的核心亚基，且全部是跨膜蛋白，对于氧化磷酸化复合物组装和发挥功能具有至关重要的作用。线粒体蛋白质合成的速率与保真性直接控制线粒体遗传信息传递的精确性、氧化呼吸链复合物的正确组装与发挥功能，进而控制线粒体代谢与重大细胞生命活动。

      线粒体氨基酰-tRNA合成酶（mt-aaRS）是关键的蛋白质合成因子，通过催化线粒体tRNA的氨基酰化反应，为线粒体内的蛋白质合成提供原料。mt-aaRS基因突变可导致常染色体隐性遗传病，其临床表型以中枢神经系统受累最为显著，亦可累及肌肉、心脏等其他组织器官。此类疾病往往临床诊断困难，发病机制不明，治疗手段极为有限，亟待深入研究。

      线粒体丝氨酰-tRNA合成酶（SARS2）催化线粒体两种tRNASer【hmtRNASer(AGY)和hmtRNASer(UCN)】的氨基酰化反应，需要特别指出的是，其中hmtRNASer(AGY)由于缺乏D-茎/环结构，是人细胞中唯一没有倒L型三级结构的tRNA。目前该基因突变的病例十分罕见，已报道患者的表型主要分为两类，一类是致死性的HUPRA综合征，以高尿酸血症、肺动脉高压、肾衰竭和碱中毒为特征性表现；另一类主要表现为进行性痉挛性四肢轻瘫。

      该研究报道了一例SARS2基因突变患者，该患者主要表现为肺动脉高压、大运动发育落后、癫痫反复发作、脑萎缩等，患者表型与已知SARS2基因突变导致的疾病既有重叠又有差异。全外显子组测序分析显示患者SARS2基因存在复合杂合突变，包括非经典剪接位点突变(c.654-14T>A)和移码突变(c.1519dupC)，均为新发现的突变。c.654-14T>A导致内含子区12个碱基的滞留，进而导致在SARS2活性中心插入了4个氨基酸（该突变体命名为Ins12），而c.1519dupC

    突变导致SARS2 C末端的缺失与异常延伸，置换了关键的C末端tRNA结合结构域（该突变体命名为dupC）。

      该研究（1）通过生物化学方法详细研究了SARS2突变体对于SARS2氨基酸活化、氨基酰化及tRNA结合能力的影响，研究发现Ins12不能催化两种线粒体tRNASer的氨基酰化，但尚可激活Ser并且结合tRNA，表明活性中心4个氨基酸的插入无法将tRNA的CCA末端正确引导到催化活性位点。而dupC对两种线粒体tRNASer的氨基酰化活力均显著受损；同时，dupC对两种线粒体tRNASer的亲和力显著受损，表明SARS2蛋白的C末端对于tRNASer的结合至关重要。（2）通过结构生物学解析与比较了野生型SARS2与Ins12的结构特征，并结合Alpha

    fold结构模拟，揭示Ins12突变体活性中心的4个氨基酸插入破坏了SARS2的二聚化能力。（3）通过建立多个诱导性多能干细胞模型，揭示患者来源细胞中的hmtRNASer(AGY) 稳态水平显著降低， hmtRNASer(UCN)未受影响，提示hmtRNASer(AGY) 的氨基酰化缺陷导致hmtRNASer(AGY) 更容易降解；此外，SARS2也可能作为tRNA的“分子伴侣”，通过与缺少D茎/环的hmtRNASer(AGY)结合后起到稳定结构的作用。氨基酰化hmtRNASer(AGY)含量的不足进一步造成患者细胞线粒体翻译系统显著下调，并且导致线粒体呼吸链氧化磷酸化产能缺陷、糖酵解过程异常、细胞内活性氧异常增多、细胞凋亡水平升高、线粒体自噬活跃及线粒体动态平衡失调，引起线粒体的稳态失衡和功能障碍。（4）通过构建Ins12与dupC小鼠模型发现，两种突变的纯合子及复合杂合小鼠均存在早期胚胎致死现象，而Sars2 Ins12与dupC杂合突变小鼠的骨骼肌组织存在两种tRNASer含量的显著下调、线粒体翻译受损以及线粒体形态异常。

      该研究鉴定了新的导致线粒体HUPRA综合征的SARS2点突变，扩展了SARS2缺陷相关的临床表型；利用分子、结构、细胞和遗传学方法与技术手段，系统解析了SARS2点突变对于SARS2结构与功能、线粒体翻译及功能的综合性影响，揭示hmtRNASer(AGY)选择性降解导致其稳态水平显著降低是SARS2基因突变导致线粒体疾病的致病机制，显著加深了人们对mt-aaRS功能缺陷相关线粒体疾病分子机理的认识。该研究为此类疾病的临床诊断、疾病干预与治疗策略开发提供了理论基础。

      相关研究工作得到科学技术部、国家自然科学基金委、中国科学院与上海市的资助。

  • 原文来源：https://www.cas.cn/syky/202211/t20221115_4854923.shtml
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  • 《脑智卓越中心揭示NMDA受体功能多样性的分子基础》
    • 来源专题：生物育种
    • 编译者：姜丽华
    • 发布时间：2023-04-13
    • 3月24日，Nature Structural & Molecular Biology在线发表了中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心竺淑佳研究组撰写的题为Distinct structure and gating mechanism in diverse NMDA receptors with GluN2C and GluN2D subunits的研究论文。该研究结合单颗粒冷冻电镜、质脂体单通道记录、电压钳记录、分子动力学模拟、质谱分析、生化验证等多维度技术，揭示了含GluN2D亚基NMDA受体的门控机制和功能特征，诠释了含GluN2C亚基NMDA受体的不对称几何构象及特异性变构调节的机制。该研究为深度理解NMDA受体不同亚型的功能多样性及开发亚型选择性的小分子药物奠定了理论基础（图1）。   NMDA受体是介导大脑突触信号传递和突触可塑性的离子通道，参与并调控神经系统的发育、学习和记忆，同时，其功能异常与诸多神经或精神疾病的发生发展密切相关，是药物研发的重要靶点。哺乳动物大脑中的不同亚型NMDA受体，其表达分布和生物物理学性质具有多样性。含有GluN2A或GluN2B亚基的受体具有较高的通道开放概率和较低的激动剂亲和力。相反，含有GluN2C或GluN2D亚基的受体具有较低的通道开放概率和较高的激动剂亲和力。然而，决定这些功能多样性的分子基础知之甚少。   GluN2D富集表达于下丘脑、杏仁核等与情绪调节密切相关的脑区。竺淑佳研究组发现，GluN1-N2D受体具有一个比其他亚型更闭合的氨基端结构域，从而使它具有较低的通道开放概率。竞争性拮抗剂R-CPP能够通过撑开谷氨酸结合口袋，进而抑制离子通道的开放。GluN1上的可变剪接5号外显子可以使激动剂结合结构域扭转，从而提高离子通道的开放活性。鉴于GluN1-N2D受体的离子通道开放概率与GluN1-N2A受体相差50倍，研究基于结构在相互作用交界面引入一对二硫键，发现交联显著性地提高了GluN1-N2D受体的通道活性（图2a-d）。上述成果揭示了GluN1-N2D亚型的门控机制以及决定其生物物理特征的分子基础。   研究进一步发现，GluN1-N2C受体采取了与经典NMDA受体所不同的特殊非对称构象。该特性决定了小分子药物PYD-106只能结合相同基因编码的两个GluN2C中的一个亚基（图2e、f）。此外，研究还解析了在小脑颗粒细胞中高表达的GluN1-N2A-N2C受体的结构。进一步分析发现，GluN1-N2A-N2C受体中的GluN2A和GluN2C亚基分别整合了对应二异四聚体中的一个单体构象（图2g）。该研究首次揭示了GluN1-N2C受体的特殊非对称几何学特性，阐释了小分子PYD-106选择性作用于GluN1-N2C受体的机制。   研究工作得到科技部、国家自然科学基金委员会、中国科学院、上海市科学技术委员会的支持。
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  • 《分子细胞卓越中心发现核仁新结构调控核糖体RNA末端加工机制》
    • 来源专题：转基因生物新品种培育
    • 编译者：姜丽华
    • 发布时间：2023-03-11
    • 3月9日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组在《自然》（Nature）上，在线发表了题为Nucleolar URB1 ensures 3' ETS rRNA removal to prevent exosome surveillance的研究论文。该工作利用高分辨率活细胞显微成像技术，通过筛选200个核仁候选蛋白质发现12个在纤维中心/致密纤维组分（FC/ DFC）外围富集的蛋白质，并命名该区域为致密纤维组分外侧区域（periphery of DFC,PDFC）。研究解析发现，位于PDFC的URB1（unhealthy ribosome protein 1）是一种具有非流动特征的核仁蛋白质，对维持PDFC的完整性、锚定pre-rRNA 3’端及保证其正确折叠和加工起到重要作用。该工作揭示了核仁的超微精细结构，为解析核仁的功能和结构提供了全新见解，并为探索核仁蛋白质在pre-rRNA加工中的功能协调以及对核糖体生成和胚胎发育影响提供了全新思路。   陈玲玲研究组长期致力于lncRNA代谢与功能的研究。前期研究通过non-poly(A)测序（Yang et al., Genome Biol 2011）发现一类新型lncRNA家族。它们来自内含子，两端以snoRNA结尾，被命名为sno-lncRNA（Yin et al., Molecular Cell 2012）。SLERT是其中一个sno-lncRNA，完全定位在细胞核仁（Xing et al., Cell 2017）。核仁是细胞核内一个复杂且高度动态变化的无膜亚结构，是细胞核内核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）的加工厂。它在调节rRNA的转录、加工以及核糖体亚基组装中具有重要作用。核仁在形态上由内而外可以分为三层结构——多个纤维中心（Fibrillar Center，FC）和致密纤维组分（Dense Fibrillar Component，DFC）形成球状结构镶嵌在颗粒区（Granular Component，GC）内。既往研究表明，SLERT直接结合核仁蛋白DDX21并调控其形成的环状结构的大小进而促进RNA聚合酶I转录（Xing et al., Cell 2017；Wu et al., Science 2021）。RNA聚合酶I转录复合物聚集在FC区域边缘对核糖体DNA（rDNA）进行转录；rRNA前体（pre-rRNA）加工蛋白质在DFC区域参与调控rRNA前体的定向转运和核仁DFC环簇状结构的组装（Yao et al., Molecular Cell 2019）。这些在FC/DFC单元产生的rRNA占细胞内总RNA的约85%，因而在FC/DFC中rRNA成熟的过程是一个受到精密调控的过程。加工修饰完成的pre-rRNA进入GC区域参与核糖体亚基的组装。核仁的重要功能毋庸置疑，但多数核仁蛋白质的精确定位及其如何参与pre-rRNA高效有序加工等基础生物学问题尚不清楚。   研究利用CRISPR/Cas9技术构建了DFC/GC双色荧光蛋白质标记的参考细胞系，在此细胞系内对200个核仁候选蛋白质进行了高分辨率的活细胞成像，并筛选到140个定位在细胞核仁不同亚结构区域的蛋白质。对这140个核仁蛋白质的研究发现，12个蛋白质定位于DFC外部，形成厚度约为200 nm的球壳状新结构，被命名为PDFC。研究进一步利用光学超分辨显微成像系统性地完善了核仁的精细亚结构分析，为更好地解析核仁组织结构和工作机制奠定了重要基础。   研究发现，PDFC关键蛋白质URB1具有分子量大、流动性慢的特征，对于维持PDFC的结构和功能颇为重要。此外，URB1还参与调控pre-rRNA 3’末端ETS 区域 （External transcribed spacer， ETS）折叠和加工。URB1在PDFC的定位参与了3’ETS的锚定、折叠与去除。URB1缺失导致3’ETS折叠异常，U8 snoRNA与pre-rRNA的结合受阻，导致3’ETS的加工异常。   这些异常的pre-rRNA中间产物在核仁中大量累积，进而激活RNA稳态监控系统（RNA Exosome）在核仁发挥活性，引发异常pre-rRNA的降解，致使成熟的28S rRNA减少，无法维持细胞内核糖体的稳态和蛋白质合成，因而造成斑马鱼和小鼠的早期发育缺陷，甚至死亡。   该工作利用超高分辨率生物成像、单分子RNA成像、RNA二级结构解析以及动物模型等多种研究手段，全面揭示了核仁精细结构与pre-rRNA的加工相互协同，共同维持核仁内微环境稳定，为认识核仁功能提供了全新见解。此外，该研究证明了URB1这类非流动性蛋白质在核仁液-液相分离环境中的关键组织作用，为探究三维pre-rRNA加工机制、核仁组装形成和功能提供了新思路。   研究工作得到中国科学院、国家自然科学基金、科技部和上海市科学技术委员会等的资助，并获得分子细胞卓越中心细胞分析技术平台、斑马鱼技术平台、分子生物学技术平台和浙江大学良渚实验室的支持。
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