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《ACS子刊：揭示新冠病毒刺突蛋白中的聚糖在病毒感染中起着重要作用》

  • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者： hujm
  • 发布时间：2020-10-12

  • 新型冠状病毒SARS-CoV-2导致2019年冠状病毒病（COVID-19），如今正在全球肆虐。科学家们正在加班加点地开发疫苗和药物，以便挫败SARS-CoV-2。许多努力都集中在这种冠状病毒刺突蛋白（S蛋白）上，S蛋白与人体细胞表面上的血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，从而使得这种病毒进入细胞。如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校、德克萨斯州大学奥斯汀分校和爱尔兰梅努斯大学的研究人员发现作为一类对S蛋白进行修饰的糖分子，聚糖（glycan）在这一过程中发挥着积极的作用，这可能为开发疫苗和药物提供了新的靶标。相关研究结果近期发表在ACS Central Science期刊上，论文标题为“Beyond Shielding: The Roles of Glycans in the SARS-CoV-2 Spike Protein”。

    在SARS-CoV-2 的S蛋白与人体细胞表面上的ACE2相互作用之前，S蛋白会改变形状以暴露它的受体结合结构域（RBD），即这种蛋白中与ACE2相互作用的部分。像许多病毒蛋白一样，S蛋白的表面包裹着一层厚厚的聚糖。这些连接在特定位置的聚糖有助于保护这种病毒蛋白免受宿主免疫系统的破坏。在这项新的研究中，这些研究人员想知道SARS-CoV-2 S蛋白中的某些聚糖是否也可能在这种病毒感染过程中发挥着积极作用。

    为了找到答案，这些研究人员利用结构数据和糖组学数据建立了嵌入病毒膜中的SARS-CoV-2 S蛋白的分子动力学模型。这些呈现了S蛋白中每个原子的详细快照的计算机模型揭示了在S蛋白的某些位置（N165和N234）与这种蛋白连接在一起的N-聚糖有助于稳定让RBD暴露出来的形状变化，从而可能有助于促进感染。这些模型还确定了S蛋白中未被聚糖包裹的区域，这些区域容易受到抗体的攻击，特别是在形状变化之后。

    在利用生物膜层反射光干涉开展的实验室实验中，他们发现，通过突变让S蛋白的N165和N234位点不再携带聚糖，可以减少S蛋白与ACE2的结合。

    这些研究人员表示，这些研究结果为开发对抗这种流行病威胁的新策略奠定了基础。

  • 原文来源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c01056;https://phys.org/news/2020-09-glycans-sars-cov-spike-protein-role.html;https://news.bioon.com/article/6779466.html
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相关报告

  • 《Science：针对刺突蛋白的新发现揭示了新冠病毒感染人细胞的能力》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2020-08-23
    • 在SARS-CoV-2感染初期，这种病毒利用它的表面上的刺突蛋白（S蛋白）附着到人体细胞上。S蛋白是疫苗研发的核心，这是因为它能触发人体免疫反应。在一项新的研究中，来自德国马克斯-普朗克生物物理学研究所（MPI）、欧洲分子生物学实验室（EMBL）、保罗-埃里希研究院（Paul-Ehrlich-Institut，PEI）和法兰克福歌德大学等研究机构的研究人员着重关注这种病毒的表面结构，以获得可用于开发疫苗和治疗感染患者的有效疗法的新见解。相关研究结果于2020年8月18日在线发表在Science期刊上，论文标题为“In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges”。 这些作者结合低温电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）、子断层扫描图平均化（subtomogram averaging）和分子动力学模拟，在近原子分辨率下分析了S蛋白在它的自然环境中、完整病毒颗粒上的分子结构。利用EMBL最先进的低温电镜成像设备，他们生成了大约1000个SARS-CoV-2病毒的266幅低温电子断层扫描图，每个病毒表面平均携带40个S蛋白刺突。子断层扫描图平均化和图像处理，再结合分子动力学模拟，最终提供了关于这些S蛋白刺突的重要和新的结构信息。 这些结果令人吃惊：他们的数据显示，S蛋白的球状部分，包含受体结合区域和与靶细胞融合所需的区域，而且这个球状部分连接到一个柔性的茎区域。论文共同通讯作者、EMBL小组负责人、MPI主任Martin Beck解释道，“S蛋白刺突的上部球状部分具有用于疫苗开发的重组蛋白很好重现的结构。然而，我们关于茎区域将S蛋白的球状部分固定在病毒表面上的发现是新的。” 论文共同通讯作者、法兰克福歌德大学生物物理学研究所的Gerhard Hummer补充道，“预计这个茎区域是非常刚性的。但在我们的计算机模型和实际图片中，我们发现这个茎区域是非常柔性的。”通过结合分子动力学模拟和低温电子断层扫描，他们确定了三个关节--髋关节、膝关节和踝关节--这三个关节赋予了茎区域的柔性。 论文共同通讯作者、保罗-埃里希研究院主任Jacomine Krijnse Locker解释道，“就像绳子上的气球一样，这些S蛋白刺突似乎在SARS-CoV-2病毒表面上移动，因此能够寻找ACE2受体以便附着到靶细胞上。” 为了防止感染，这些S蛋白刺突可由抗体加以靶向。然而，这些图片和模型还显示，整个S蛋白，包括它的茎区域，都覆盖着聚糖（glycan）链。这些聚糖链提供了一种保护性的外层，从而让这些S蛋白刺突免受中和抗体的攻击：这是研制有效疫苗和药物的另一个重要发现。
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  • 《Nature全文编译！揭示新冠病毒刺突蛋白在完整病毒颗粒上的结构和分布》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2020-08-23
    • 新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，是一种包膜病毒，含有较大的由核衣壳蛋白（N）包裹的正义RNA基因组。三个跨膜蛋白被整入病毒脂质包膜：刺突蛋白（S）和两个较小的蛋白，即膜蛋白（M）和包膜蛋白（E）。当通过低温电镜（cryo-EM）成像时，β冠状病毒呈近似球形颗粒，直径在100纳米上下浮动，内含致密的病毒质（viroplasm），由突脂质双层包围着，S蛋白三聚体（下称S三聚体）从脂质双层中突出。SARS-CoV-2的S三聚体结合到靶细胞表面上的受体ACE2，并介导随后的病毒摄取和融合。在这样做的过程中，S蛋白经历了显著的结构重排，从融合前的构象切换到融合后的构象。S蛋白融合前和融合后的整体结构在冠状病毒中是非常保守的。 在感染过程中，冠状病毒广泛地重塑细胞的内部膜结构，产生病毒复制细胞器以便在其中进行病毒复制。S蛋白，连同蛋白M和E，被插入到内质网（ER）的膜中，并被运送到内质网-高尔基体中间区室（ER Golgi intermediate compartment, ERGIC）。封装的基因组出芽到ERGIC中以形成病毒颗粒，随后将病毒颗粒运送到质膜并释放出去。S蛋白是通过先在S1/S2位点随后在S2'位点进行蛋白酶切割，从而为膜融合做好准备。 包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒的S蛋白融合前结构已通过可溶性的分泌形式的S蛋白异位表达，随后进行纯化和cryo-EM成像，得到了广泛研究。在S蛋白融合前结构中，受体结合结构域（RBD）位于融合核心（fusion core）上方的一个较宽的S三聚体刺突结构的顶部。在含有三个RBD的S三聚体中，每个RBD被一个显示出一定流动性的N端结构域（NTD）包围着。在封闭的融合前结构中，所有三个RBD平铺在刺突结构表面上，在很大程度上封闭了受体结合位点，而在开放的融合前结构中，一个或多个RBD向上抬起，从而暴露受体结合位点。S三聚体的表面发生广泛的糖基化，每个S蛋白单体有22个潜在的N-糖基化位点。在结合受体ACE2后，从融合前到融合后的结构转变让S蛋白的融合肽和跨膜结构域聚集在一个以三螺旋束为中心的长针状结构的一端。五个N连接的聚糖沿融合后的S三聚体刺突结构的长度间隔分布。 充分理解S蛋白如何发挥作用，以及它们如何与免疫系统相互作用，需要了解病毒颗粒内S三聚体的结构、构象和分布。在一项新的研究中，来自英国医学研究理事会分子生物学实验室和德国海德堡大学的研究人员利用cryo-EM方法研究了S三聚体在病毒颗粒表面上的结构、构象和分布。相关研究结果于2020年8月17日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions”。 为了避免与病毒浓缩或纯化相关的伪影（artefacts），这些作者想要在不浓缩或纯化病毒的情形下对来自感染细胞的上清液的SARS-CoV-2病毒进行成像。利用SARS-CoV-2（病毒分离株Germany/BavPat1/2020）感染VeroE6细胞。在感染48小时后，上清液经澄清后用甲醛固定灭活，并在-80℃下储存。蛋白印迹法（Western blot）显示，病毒颗粒上大约45％的S蛋白单体在多精氨酸切割位点上切割成S1和S2（图1a）。固定的上清液通过骤冻玻璃化，并通过cryo-EM成像。固定可能有助于通过交联让一些蛋白构象稳定化，但预计不会产生任何新的构象。正如预期的那样，考虑到细胞上清液中病毒的浓度（约107个噬菌斑形成单位/ml, PFU/ml），他们发现少量的病毒颗粒分散在网格周围---这些病毒颗粒通过低温电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）成像（图1b）。 SARS-CoV-2病毒颗粒是近似球形的，到脂质双层外边缘的直径为91±11纳米（n = 179）。它们含有与N蛋白相对应的颗粒状密度，并缀有S三聚体（图1b,c）。这些特征与利用cryo-EM成像的其他冠状病毒的特征基本一致。从这种病毒表面上突出的S三聚体有两种形态--少数是延长的薄结构，这让人联想到融合后的构象，而大多数是更宽的结构，这让人联想到融合前的构象。这一观察结果与近期在预印本服务器上发表的一份论文（bioRxiv, 2020, doi:10.1101/2020.03.02.972927）---该论文显示了用核酸修饰剂β-丙内酯灭活的纯化SARS-CoV-2病毒的cryo-EM图像，在该图像中仅在病毒表面上观察到薄薄的突起---形成了鲜明的对比，但与原位观察到的病毒组装相一致。 这些作者还收集了SARS-CoV-2感染CALU-3细胞后产生的病毒颗粒的断层扫描图，其中Calu-3细胞是一种人肺癌细胞系，在病毒感染上产生的病毒滴度与VeroE6细胞相当。CALU-3细胞产生的这些病毒颗粒的形态和S三聚体在病毒颗粒表面上的外观与从VeroE6细胞产生的病毒颗粒所观察到的相一致。蛋白印迹分析表明，约73%的S蛋白为裂解形式。 SARS-CoV-2病毒颗粒含有24±9个S三聚体。这个值低于之前假设S蛋白等距离分布的估计值，这是因为S蛋白在病毒表面分布不均匀。一小群病毒颗粒仅含有很少的S三聚体，而较大的病毒颗粒则含有更多的S三聚体。这些作者从179个病毒颗粒中鉴定出4104个宽的S三聚体和116个薄的S三聚体，并对它们进行子断层扫描图平均化（subtomogram averaging）。平均化的结构，在7.7和22埃的分辨率下，分别非常好地对应于之前公布的纯化S三聚体在融合前和融合后形式下的结构（图2a）。总体而言，约97％的S三聚体是融合前形式，3％是融合后形式。融合前和融合后的S三聚体形式似乎是均匀地分布在病毒颗粒中。 病毒表面上的融合前S三聚体可能主要处于封闭构象，它的开放构象可通过ACE2结合诱导或稳定化，或者它在融合前也可能存在开放构象。当用作免疫原时，开放或封闭的构象可诱导不同范围的抗体，目前人们正在努力产生稳定在其中一种构象的S蛋白构造体。 为了评估S三聚体是否存在于开放和/或封闭的构象，这些作者对S三聚体中的S蛋白单体的RBD区域进行分类。他们发现三种类型：RBD处于封闭位置的S蛋白；RBD处于开放位置的S蛋白；RBD以封闭位置为主但密度有所减弱的S蛋白，这表明存在更多的可移动构象。 考虑到每个S蛋白单体被分配到的类型，这些作者推导出完全封闭的S三聚体结构，以及其中一个RBD是开放的S三聚体结构，这两者分别代表了3854个融合前S三聚体中的约31％和约55％（图2b）。他们还发现了少量S三聚体（3854个融合前S三聚体中的约14％）的两个RBD处于开放构象（图2b）。这些观察结果证实在重组S三聚体中观察到的RBD的开放也发生在病毒表面上，并且稳定在封闭和开放构象中的人工S蛋白构造体都代表了原位存在的结构。因此，这种受体结合位点在原位随机暴露，并可与ACE2以及与抗体相互作用。 这些S三聚体并不都是直接从病毒表面突出来的。它们可以向膜倾斜90°，尽管倾斜超过50°就不那么有利。这些作者根据S三聚体相对于膜的方向对它们进行分组，并且分别对每组进行平均化。这些平均化的结构表明膜近端茎区域作为一个铰链有足够的灵活性，允许向各个方向倾斜（图2c）。 这些作者构建出SARS-CoV-2病毒颗粒的模型，在该模型中，S三聚体的位置、方向和构象是通过子断层扫描图平均化确定的（图2d）。S三聚体似乎是随机分布在病毒表面上，它们的位置、方向和构象之间没有明显的聚类或关系。在SARS-CoV-2中，每1000 平方纳米膜表面大约有一个S三聚体，相比之下，在甲型流感病毒中，每100平方纳米膜表面大约有一个S三聚体。在SARS-CoV-2中，S蛋白的稀疏分布以及它们主要处于封闭状态意味着与大流行性流感病毒相比，受体结合可能较少依赖于亲和效应。这与S蛋白和ACE2之间的亲和力（在nM范围内）比血凝素和唾液酸之间的亲和力（mM范围）高相一致。 上清液中低浓度的病毒颗粒使得解析出高分辨率的结构变得困难。因此，这些作者通过蔗糖垫层离心沉淀法对这些病毒颗粒进行浓缩。浓缩的病毒颗粒偏离球形形态，但是它们的整体特征仍保留下来。他们对这些病毒颗粒进行了cryo-ET成像和子断层扫描图平均化，观察到的主要是融合前S三聚体，偶尔有融合后S三聚体。在对融合前S蛋白进行分类后，他们只能识别出处于封闭位置的RBD，以及观察到RBD密度较弱的S蛋白单体。 从感染细胞的上清液中的病毒颗粒主要显示融合前S三聚体，这些S三聚体处于封闭或开放的融合前构象。通过蔗糖垫层离心法浓缩的病毒颗粒继续呈现融合前构象，但不再观察到开放构象。其他研究已表明，用β-丙内酯，而不是甲醛灭活的病毒颗粒主要处于融合后状态。从膜中纯化的S三聚体仅处于封闭的融合前构象和融合后构象，而其他研究已提示着可溶性S三聚体中的开放RBD是在一系列连续不同的位置中发现的。这些观察表明这些作者在浓缩之前而不是浓缩之后观察到的S蛋白的开放融合前构象是脆弱的（尽管文中进行了固定），并可能受到纯化过程的影响。 这些作者的数据提示着灭活和纯化方法可以改变融合前和融合后形式的比例，以及开放和封闭形式的比例。据推测，病毒表面上大量的融合后S蛋白可能通过屏蔽融合前形式保护这种病毒，或者可能将宿主反应转向非中和抗体。鉴于在完整的病毒颗粒上观察到小一部分融合后S三聚体刺突结构，这些作者认为这不太可能是病毒在感染过程中的重要防御机制，但它可能是疫苗接种的一个重要考虑因素。基于灭活病毒颗粒的候选疫苗正在开发中。根据不同的制备方式，这些疫苗可能会向免疫系统呈现不同的S蛋白表位，因此它们诱导中和反应的能力也不同。比如，β-丙内酯经常用于疫苗生产（如用于流感病毒亚单位疫苗），但如果融合后S三聚体诱导非中和反应，那么β-丙内酯可能不是SARS-CoV-2病毒S蛋白疫苗配方制备期间用于病毒灭活的最佳选择。 接下来，这些作者利用cryo-EM对浓缩的SARS-CoV-2病毒进行二维成像，并对那些从病毒颗粒侧面突出的融合前S三聚体进行单颗粒分析，从而产生3.4埃分辨率的融合前S三聚体共识结构。对RBD单体进行集中分类和部分信号减法，可将它们分为两类。与通过cryo-ET发现样品中不存在开放构象相一致的是，这些作者观察到81%的S蛋白单体中RBD处于封闭构象，19%的S蛋白单体中RBD的密度较弱，但主要处于封闭位置。他们将所有三个RBD都处于封闭构象的S三聚体（53％的数据）以及至少一个RBD的密度减弱的S三聚体（47％的数据）的结构分别优化到3.5埃和4.1埃的分辨率（图3a）。这两种结构高度相似，仅在一个RBD的密度水平上有所不同。他们利用这种具有三个封闭RBD的结构，建立并完善了S三聚体在病毒表面原位的原子模型。 在这些作者建立的结构中，S蛋白表面上的聚糖位置得到了很好的解决：在22个预测的N-糖基化位点中，有17个存在密度（图3b）。其他5个糖基化位点位于无序的NTD环或茎区域，并没有在高分辨率下解决。在S三聚体的底部，一个清晰的聚糖环在茎区域上形成一个项圈。相比于已公布的可溶性胞外结构域结构，茎区域的密度延伸了2个螺旋转弯（helical turn）并在更低的分辨率下进一步延长，直到由于茎区域的灵活性而逐渐消失（图3c）。SARS-CoV-2的S三聚体分布稀疏，可以高度向膜倾斜。这意味着，在头部区域基部和茎区域的抗原表位将被抗体接触到，在那里它们得不到聚糖壳的广泛保护。 这些作者比较了S三聚体的原位结构和以前使用外源表达的纯化蛋白获得的结构。最近的一项针对溶于去污剂胶团的全长S三聚体的研究确定了在可溶性S蛋白胞外结构域三聚体的大多数结构中没有观察到的两个特征：S蛋白的氨基酸残基14-26存在明确的密度；S蛋白的氨基酸残基833和853之间形成折叠环（folded loop）。这个环是在S蛋白胞外结构域的封闭构象结构中折叠形成的，并可能在内体（endosome）的低pH条件下折叠。这些作者仅在氨基酸残基14-26观察到较弱的密度，但是他们没有观察到833-853区域形成折叠结构。这些作者进行过成像的SARS-CoV-2毒株含有广泛传播的D614G替换突变，这种突变破坏了这个氨基酸残基与K854之间形成的盐桥（图3d），并可能减少833-854折叠环的折叠。他们没有观察到对应于结合型脂质或其他结合型辅助因子的额外密度。S三聚体可能以罕见的构象存在着，但这不是它们在原位时的一般特征。 总的来说，这些作者确定的结构非常类似于通过双脯氨酸突变进行稳定化的可溶性三聚体胞外结构域在封闭融合前形式下的结构。这对正在使用的重组纯化S三聚体用于研究、诊断和疫苗接种提供了重要的验证，毕竟它们确实代表了S三聚体的原位结构。通过展示S三聚体在病毒表面上在3.4埃分辨率下的结构（图3），这些数据让这些作者乐观地认为，cryo-EM可以用于研究抗体结合病毒颗粒表面上的S三聚体。这样的研究可能提供中和抗体如何阻断病毒感染的新见解，特别是靶向S蛋白的膜近端区域的抗体，从而可以为用于疫苗接种的免疫原设计提供信息。
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