近日，南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队的硕士研究生杨嘉伟、陈芳副教授、邓泽元教授等人在国际期刊 Food Bioscience发表了题为“Research on the anti-aging activity of different mulberry leaf Products:Based on mulberry leaf powder and mulberry leaf extract”的文章。本研究聚焦桑叶粉（MLP）和桑叶提取物（MLE）在体内的代谢差异和抗衰老活性。在体内代谢实验中MLP 组多酚的控释效果优于 MLE 组；在抗衰老实验中MLP 和 MLE 干预在调节肠道微生物群、氧化还原平衡和小鼠行为表现方面均显示出效果，但在大多数情况下，MLP 的效果比 MLE 更显著，表明桑叶中膳食纤维和酚类化合物的协同抗衰老作用。2023级硕士研究生杨嘉伟为本文的第一作者，通讯作者为陈芳副教授。 # Highlights # 1、与MLE相比，MLP表现出延长多酚的释放。 2、MLP对氧化还原稳态和认知功能的作用优于MLE。 3、MLP而不是MLE恢复了衰老小鼠肠道微生物群的组成。 4、MAPK信号通路可能参与桑叶的抗衰老活性。 # Introduction # 衰老是组织和器官功能逐渐下降的不可避免的生物学过程，导致一系列生理和病理变化。自由基理论认为，过量自由基可损害细胞结构和功能。桑叶是“药食同源”植物材料，在中国传统医学中广泛使用。中国药典（2020）记载桑叶有疏散风热、清肺润燥、清肝明目等功效。现代药理学研究表明，桑叶含多种植物化学物质，如酚类和生物碱，具有抗氧化、抗衰老、抗炎和抗菌作用。但大多数研究集中在桑叶提取物，对桑叶作为“全食物”的研究较少。“全食物”指未加工或仅经过最小加工的食物，通常以原始状态食用，可最大限度地保留营养成分。多项研究证实，食品基质中的植物化学物质在体内外的抗氧化能力与提取物存在显著差异。目前，关于桑叶粉作为“全食物”及其乙醇提取物的酚类化合物在体内的代谢和生物活性的综合研究较少。 多项研究表明，肠道微生物群在抗衰老中起重要作用。衰老和年轻个体的肠道微生物群组成和结构存在显著差异。例如，随着年龄增长，微生物群多样性、核心物种丰度、双歧杆菌数量和糖酵解细菌减少，而蛋白水解细菌、次级优势物种丰度和变形菌门增加。物种相对丰度差异与多种年龄相关疾病有关。先前研究证实，天然产物中的多种活性成分（包括膳食纤维、多酚和多糖）可改变肠道微生物群组成。目前关于桑叶调节肠道微生物群的研究主要集中在 2 型糖尿病、抗肥胖和代谢调节方面，与抗衰老相关的研究较少。因此，本文旨在探究桑叶是否可调节衰老小鼠的肠道微生物群。 网络药理学是一种揭示中药等药物复杂机制的新方法。通过整合系统生物学、生物信息学和计算机科学，网络药理学形成“药物-靶点-疾病”的系统网络，可识别药物靶点，从整体角度分析药物作用，并预测药物对疾病的潜在作用机制。本研究旨在探究桑叶粉和桑叶提取物在代谢模式和抗衰老效果上的差异，评估桑叶产品对衰老小鼠肠道微生物群的调节作用，基于网络药理学预测抗衰老的潜在机制，并通过分子生物学技术进行验证，为桑叶的开发利用提供科学依据。 # Results and Discussion # 1、桑叶成分的鉴定 通过 UPLC-QExactive Focus 鉴定桑叶的植物化学成分。根据保留时间（RT）、MS/MS 数据、碎片离子、分子质量、文献和数据库，共鉴定出 52 种化合物，包括 24 种酚类及其衍生物和 28 种非酚类化合物。 2、MLP 和 MLE 在体内的代谢研究 接下来，我们比较了 MLP 和 MLE 在体内多酚代谢的差异。我们筛选了仅在灌胃 MLP 和 MLE 后出现而非 0 小时时出现的峰，鉴定其为桑叶酚类成分的代谢物。表 2 显示了血浆中代谢物的信息。如图 1A 和 B 所示，灌胃 MLP 后，血浆中 1 小时出现 6 种酚类代谢物，3 小时出现更多代谢物（10 种），6 小时出现 9 种。相比之下，灌胃 MLE 后，1 小时、3 小时和 6 小时分别鉴定出 13、10 和 6 种酚类代谢物。 然而，MLP 和 MLE 之间的代谢物类型差异不大。这些结果表明 MLP 可能对酚类物质具有缓释作用。研究表明，桑叶中含有被纤维包裹在细胞质中的粘液多糖，这可能是由于这些水溶性多糖的存在，使得桑叶粉中酚类物质的释放速度变慢（Katayama 等，2008）。 3、桑叶改善 D-半乳糖诱导的衰老小鼠 为了比较桑叶作为“全食物”与桑叶提取物的抗衰老活性，我们研究了不同桑叶产品（MLP、MLE、MLR 和 MLM）对衰老小鼠的影响（图 2A）。 3.1 桑叶改善 D-半乳糖诱导的衰老小鼠的精神状态 我们首先评估了给药结束时小鼠的精神和身体状况。MC 组小鼠表现出精神抑郁、反应和行动迟缓、皮肤松弛、活动减少等衰老迹象。与 MC 组相比，所有用桑叶产品和 VC 处理的小鼠在精神和外观状态上都有所改善。经过 8 周后，7 组小鼠的平均体重无显著差异。 3.2 桑叶增加 D-半乳糖诱导的衰老小鼠的器官指数 计算小鼠的器官指数，结果见表 3。与 NC 组相比，MC 组的器官指数降低，肝脏、心脏、肾脏、脾脏和胸腺指数显著降低（P<0.05）。相比之下，桑叶产品处理后，这种现象得到了显著缓解。与 MC 组相比，MLM 显著提高了肾脏、心脏、脾脏和胸腺指数（P<0.05），MLP 显著提高了心脏和脾脏指数（P<0.05），MLE 显著提高了脾脏和胸腺指数（P<0.05）。总体而言，MLM、MLP 和 MLE 在一定程度上可以改善与衰老相关的免疫系统恶化和器官损伤。 3.3 桑叶增强 D-半乳糖诱导的衰老小鼠的抗氧化能力 研究了桑叶对血清抗氧化指标的影响。如图 2C 所示，与 NC 组相比，MC 组血清中 MDA 水平显著升高（P<0.05），T-AOC 和 GSH-PX 水平降低（P<0.05）（图 2D 和 E）。而补充桑叶产品可以缓解血浆氧化应激水平（P<0.05）。这些结果表明，桑叶产品可以减少 D-半乳糖诱导的脂质过氧化，增强抗氧化能力，MLP 和 MLM 的效果更为显著。 3.4桑叶改善 D-半乳糖诱导的衰老小鼠的记忆缺陷 OFT 和 MWM 是评估衰老动物空间学习和记忆能力的经典实验。在 OFT 中，与 MC 组相比，桑叶产品处理组显著增加了衰老小鼠在 5 分钟内的总距离、平均速度和直立运动次数（P<0.05，图 2F-H）。在 MWM 的定位导航部分，与 MC 组相比，所有桑叶产品都缩短了逃避潜伏期，但各处理组之间没有显著差异。在 MWM 的空间探索阶段，MC 组的逃避潜伏期显著高于 NC 组（P<0.05，图 2I），而 MLP、MLE 和 MLR 处理显著缩短了衰老小鼠的逃避潜伏期（P<0.05）。各组在目标象限的移动距离百分比无显著差异（图 S3B）。MLE 在增加目标象限移动时间百分比方面表现出最大改善（P<0.05，图 S3C）。综上所述，这些结果在一定程度上表明，MLP 和 MLE 可以延缓衰老引起的行为变化，对延缓大脑衰老有作用。 3.5 桑叶保护 D-半乳糖诱导的衰老小鼠肝脏免受氧化损伤 如图 2J 所示，NC 组显示正常的肝脏结构。MC 组小鼠的肝组织表现出细胞排列紊乱、肝细胞核大小和形状不一、核质边界不清晰、肝细胞边缘模糊、细胞质稀疏、肝窦扩张和变形，表明肝脏形态和结构受损。与 MC 组相比，VC 和各桑叶产品处理后，小鼠的整体肝脏状况显著改善。如表 S3 所示，与 NC 组相比，MC 组得分显著增加（P<0.05）。相反，PC 组和所有桑叶产品组与 MC 组相比得分明显降低（P<0.05）。总体而言，PC 和所有桑叶产品可以缓解 D-半乳糖诱导的衰老小鼠的肝脏损伤。 4、桑叶对 D-半乳糖诱导的衰老小鼠肠道微生物群的影响 4.1多样本比较分析 用花瓣图表示不同组小鼠肠道微生物群的共有和特有物种数量（图 3A）。MC 组仅有 122 种特有物种。其他组的特有物种数量均多于 MC 组。MLP、MLR 和 MLM 的特有物种数量高于 MLE。如图 3B 所示，MC 组和 NC 组之间的重叠有限，表明它们之间的肠道微生物群的丰度和多样性存在显著差异。VC 和所有桑叶产品的给药可以在一定程度上增加肠道微生物群的多样性，并恢复衰老小鼠肠道微生物群的结构组成。特别是 MLM 组和 NC 组的肠道微生物群的丰度和多样性最为相似。 4.2 桑叶对衰老小鼠肠道微生物群多样性和相对丰度的影响 Alpha 多样性指数可用于评估不同样本中微生物群落的物种丰富度和多样性差异。图 3C 和 D 显示了小鼠肠道微生物群的 Shannon 和 Chao1 Alpha 多样性指数。与 MC 组相比，PC 组和所有桑叶产品组的 Shannon Alpha 多样性指数显著更高。而当与 MC 组相比时，PC、MLP、MLR 和 MLM 组的 Chao1 Alpha 多样性指数显著更高。在所有桑叶组中，MLE 组的这些指数最低。这表明 MLP、MLR 和 MLM 组的肠道微生物群多样性指数高于 MLE 组。 在每个组中，选择了相对丰度最高的前 10 个物种，生成了物种相对丰度的累积条形图（图 3E）。在所有样本中，检测到的细菌超过 90% 属于以下十个门：厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、弯曲菌门、脱硫菌门、待分类细菌、疣微菌门、变形菌门、铁还原菌门和酸杆菌门。结果显示，所有组中相对丰度最高的两个门是厚壁菌门和拟杆菌门。与 NC 组相比，MC 组的厚壁菌门丰度更高，拟杆菌门丰度更低（P<0.05，图 3F 和 G）。而 MLP、MLE 和 MLR 的干预显著增加了拟杆菌门的水平，并降低了厚壁菌门与拟杆菌门的比率（P<0.05，图 3F 和 G）。NC 组和 MC 组中拟杆菌门和厚壁菌门的差异结果表明，这些门可能与小鼠衰老有关。接下来，进行线性判别分析效应大小（LEfSe）分析以识别每组的特征细菌。如图 3H 所示，在 7 组样本中筛选出 19 种特征物种。MC、MLP、MLE 和 MLM 组分别有 6、5、5 和 3 种物种。在各种治疗组中，已报道与抗衰老有益的细菌被识别出来。与 NC 组相比，MC 组中 Muribaculaceae 的相对丰度显著降低（P<0.05）。与 MC 组相比，MLP、MLE 和 MLR 均显著增加了有益菌 Muribaculaceae 的相对丰度（图 3I）。NC 组和 MC 组中 Muribaculaceae 的差异结果表明，Muribaculaceae 可能与小鼠衰老有关。然而，只有 MLP 组显著增加了 Odoribacter 的相对丰度（P<0.05，图 3J）。MLP 和 MLM 分别增加了 Rikenellaceae 和 Turicibacter 的相对丰度，但差异不显著（图 3K 和 L）。 5、网络药理学分析桑叶的抗衰老信号通路 除了研究肠道微生物群外，我们还利用网络药理学方法分析了桑叶抗衰老的潜在分子机制，并用西方印迹法进行初步验证。 基于上述体内代谢研究，氯原酸、芦丁、异鼠李素和积雪草苷是桑叶酚类物质在血液中的主要原型物质。此外，奎宁酸、咖啡酸、二羟基咖啡酸、槲皮素和山柰酚被确定为主要代谢物。利用 SwissTarget 和 Pharmmapper 数据库搜索这 9 种代表性化合物的靶点。合并两个数据库的结果并删除重复靶点后，获得 222 个与物质相关的靶点。使用 HAGR 和 Genecards 数据库以“衰老”为关键词查找与衰老相关的靶点。整合两组数据并删除重复靶点后，确定了 26458 个与衰老相关的靶点。随后，使用 Venny2.1 对物质相关靶点和衰老相关靶点进行交集分析（图 4A 和 B）。共确定了 21 个关键靶点，包括肿瘤坏死因子（TNF）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（AKT1）、血管内皮生长因子（EGFR）、人半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶 3（CASP3）等。 在 DAVID 网站上，将关键靶点进一步提交至 GO（基因本体）和 KEGG 富集分析（图 4C 和 D）。在 GO 分析中，选择了 P≤0.05 的 BP（生物过程）、MF（分子功能）和 CC（细胞组分）的前 10 个条目。结果表明，核心靶点与一氧化氮生物合成的正向调节、MAP 激酶活性、凋亡、细胞对活性氧的反应等生物过程相关。KEGG 富集分析揭示了与桑叶抗衰老作用相关的通路，包括 MAPK 信号通路、TNF 信号通路、缺氧诱导因子（HIF-1）信号通路等。进一步构建的“活性成分-靶点-通路”网络如图 4E 所示。 桑叶对 MAPK 信号通路蛋白磷酸化的影响如图 4F 和 G 所示。在小鼠肝脏中，D-半乳糖注射显著增加了 p-ERK/ERK 和 p-JNK/JNK 比率，但对 p-p38/p38 比率没有显著影响。桑叶处理组的 pERK/ERK 和 p-JNK/JNK 比率明显降低。这些发现表明，桑叶可以有效抑制 MAPK 信号通路中 ERK 和 JNK 的磷酸化水平，尽管各处理组之间没有显著差异。这些结果表明，MAPK 信号通路可能参与了桑叶的抗衰老作用。 # Conclusions # 本研究比较了 MLP 和 MLE 的体内代谢差异和抗衰老效果，并探讨了潜在机制。发现与 MLE 相比，MLP 对酚类物质具有缓释作用，抗衰老效果更为显著。MLP 和 MLE 均能缓解衰老小鼠肠道微生物群的紊乱，并调节与 MAPK 信号通路相关的蛋白磷酸化水平。总体而言，本研究可能是首次报道桑叶中膳食纤维和多酚的协同抗衰老作用，为全桑叶粉的开发利用提供了新的方向，并为抗衰老产品的开发提供了理论依据。 # Authors # 杨嘉伟 硕士 杨嘉伟，2023级营养与食品卫生学硕士研究生。主要研究方向为植物化学物。 章旭 硕士 2020级公共卫生硕士研究生。主要研究方向为桑叶的抗衰老活性。 陈芳 副教授 陈芳，博士，副教授，硕士研究生导师，江西省主要学科学术和技术带头人，江西省优博，赣江青年学者，南昌大学青年岗位能手，中国营养学会营养转化医学分会委员，中国营养学会营养与组学技术分会委员，江西省营养学会常务理事，南昌市营养学会副会长，第一届《食品研究与开发》青年委员。主要研究方向：膳食因素与健康的关系及作用机制研究，健康食品开发与研究。近年来主持国家自然科学基金2项，江西省自然科学基金3项，南昌大学医学部青年教师培育项目1项，企业横向课题2项，参与完成国家、省部级项目6项，在Food Hydrocolloids，Phytomedicine，J. Agric. Food Chem.等期刊上发表论文40余篇，申请/授权专利4项。获评江西省创新争先团队（骨干成员）。主、参编教材/专著6部。获得南昌大学本科生优秀班级导师，南昌大学青年教师授课比赛三等奖，校级教学成果奖二等奖，指导本科生参加“正大杯第十四届全国大学生市场调查与分析大赛总决赛”获得全国一等奖。 邓泽元 教授 邓泽元，二级教授，博士生导师。南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室固定研究人员。享受国务院特殊津贴，赣鄱英才555工程人才、江西省新世纪百千万人才工程人选，江西省高校中青年学科带头人，首届江西省优秀硕士指导教师，江西省高等学校教学名师，获得教育部优秀中青年教师（支助），江西省主要学科学术与技术带头人，“食品科学”与“营养与食品卫生学”重点学科带头人。现任中国农学会微量元素与食物链分会副理事长，中国粮油学会营养分会副会长，中国营养学会营养转化医学分会副主任委员，江西省微量元素与健康研究会名誉理事长，江西省营养学会理事长；美国化学学会（ACS）会员、国际食品学会（IFT）会员，《食品科学》、《农产品加工学刊》、《食品安全质量检测学报》、《乳业科学与技术》、《南昌大学学报》（理科版）、J of Agri. Food Chem.和J of Food Biochem.编委，中国保健食品评审专家。
