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《Cell | 基于 AsCas12f 的深度突变扫描和结构分析的紧凑型基因组编辑工具》

  • 来源专题：战略生物资源
  • 编译者： 李康音
  • 发布时间：2023-10-01

  • 2023年9月29日，京都府立大学的研究人员在Cell上发表题为An AsCas12f-based compact genome-editing tool derived by deep mutational scanning and structural analysis的文章。

    研究人员创建了一个可能的 AsCas12f 突变库，然后将选定的突变组合起来，设计出一种 AsCas12f 酶，其编辑能力比原始未突变类型高 10 倍。 这种工程化的 AsCas12f 已经在小鼠身上进行了成功测试，并且有可能在未来用于为患者提供新的、更有效的治疗方法。




    本文内容转载自“我爱生化”微信公众号。

    原文链接: https://mp.weixin.qq.com/s/qrJdkn5rmZXRqx-UJ_Szwg

  • 原文来源：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867423009637
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  • 《Cell综述 | CRISPR基因组编辑技术的过去、现在和未来》
    • 来源专题：战略生物资源
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2024-03-04
    • 2024年2月29日，苏黎世大学的研究人员在 Cell 期刊发表了题为Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies的综述论文。在这篇综述中，作者讨论了CRISPR基因编辑技术在研究和治疗方面的现状，强调了限制它们的局限性和近年来开发的技术创新来解决这些问题。此外，还检查和总结了基因编辑在人类健康和治疗方面的当前应用情况。最后概述了未来可能影响基因编辑技术及其应用的潜在发展。 基因组编辑，即对生物体遗传物质进行精确和有针对性的修改，是分子生物学领域最重大的进展之一。它具有深远的应用，从揭示基本的生物学过程到推动医学、农业和生物技术的发展。随着2023年底首次批准基于CRISPR疗法用于人类疾病治疗，CRISPR基因组编辑正在进入一个新时代。该综述旨在提供CRISPR基因组编辑全景视角，强调其当前状态、潜在的未来发展以及必须克服的障碍，以充分实现其在人类医学中的承诺。 CRISPR-Cas核酸酶的可编程性使其能够产生位点特异性的DNA双链断裂，从而使其能够快速适应基因组编辑技术。来自化脓链球菌的典型Cas9蛋白（SpCas9）是第一个被用于基因组编辑的Cas核酸酶，由于其固有的高活性和特异性，目前仍然是最广泛使用的基因编辑器。Cas12a是一种起源于V型CRISPR-Cas系统的Cas核酸酶，在Cas9之后几年被发现，同样被用于基因组编辑。与Cas9不同，Cas12a不需要tracerRNA进行激活，这一特点已被用于体内多重编辑。 CRISPR-Cas系统作为简单有效的可编程基因编辑工具的重新应用，极大地推进了许多基础和应用研究领域，为开发靶向基因治疗和各种生物技术应用奠定了基础。然而，高度进化的生物防御系统的功能特征与精确的基因组编辑工具的功能有所不同。因此，第一代基于CRISPR的基因编辑工具的应用潜力受到几个关键因素的限制，主要包括特异性、靶向范围，以及依赖内源性DSB修复机制来实现基因组编辑，此外，CRISPR组分的递送受到递送载体和目标细胞或生物体的特定限制。 自基于CRISPR的基因编辑首次展示以来，该领域已经得到了前所未有的发展。基于Cas9和Cas12a核酸酶的第一代DNA双链断裂依赖性基因组编辑器的功能已经通过不断创新得到增强，这些创新不仅增加了这些工具的多功能性，还提高了它们的精度并最小化了非预期编辑后果。然而，对于它们安全性的担忧仍然存在，这既是因为脱靶编辑活性，也由于靶向DNA双链断裂的潜在基因毒性效应。为了减少非预期编辑的发生，已经探索了多种方法来精确地控制CRISPR基因组编辑器。 CRISPR基因组编辑技术的发展带来了一系列具有显著潜力的应用，从基础研究的进步到新治疗方法的开发。首先，CRISPR已经改变了遗传学研究，使科学家能够在各种实验模型中模拟致病突变，创建大规模的全基因组筛查方法，并开发合成基因记录设备来研究正常发育和疾病进展。CRISPR系统还被被用于开发分子诊断，使病毒DNA或RNA的检测变得特异、快速和灵敏。其次，CRISPR技术还被用于建立消除病毒或细菌人类病原体的策略，后者是通过开发工程噬菌体实现的。限制病原体传播的一个具体例子是基于CRISPR的基因驱动，其中引入特定的抑制性特征（例如雌性不育），以摧毁携带病原体的昆虫种群（主要是传播疟疾等疾病的蚊子）。最后，过去十年的CRISPR基因组编辑已经发展出多种治疗遗传病的方法，其中一些已经从基于细胞和动物模型的临床前研究进入了人类临床试验。这包括体内和体外治疗纠正策略。体内治疗纠正方法涉及将基因编辑组件输送到人体内部受影响的组织。相比之下，体外方法涉及从患者身上收集细胞，在实验室中编辑它们，然后将编辑后的细胞移植回患者体内。此外，体外CRISPR编辑还使自体和异体基因组修饰的细胞疗法的产生成为可能，主要用于癌症免疫治疗。 随着当前CRISPR技术的局限性在过去十年中变得越来越明显，新的方法和方法学不断发展和优化，以解决这些限制并提高基于CRISPR的基因组编辑的效率和多样性。这些新兴的第三代工具和技术，包括最近发现的紧凑型RNA引导核酸酶类，这些核酸酶已被用于基于DNA双链断裂的编辑，并可作为其他基因组编辑器（例如碱基编辑和先导编辑）的RNA引导的DNA结合平台。 在基因组编辑领域，向宿主基因组中插入大片篇的DNA序列，特别是在缺乏同源定向修复（HDR）的非分裂细胞中，仍然是一个主要的未满足需求。在这种背景下，CRISPR引导的重组酶和转座子的开发提供了一种有前途的和潜在强大的途径来填补这一技术缺口。基于逆转录转座子的基因组编辑技术和编辑RNA转录本的新方法也已经出现。最后，新的基因组编辑工具的创建继续与递送方法的发展相伴而行，这对治疗应用构成了重大挑战。 总的来说，这些进步反映了快速发展的基因组编辑领域的动态，其中每种新方法都提供了互补的优势，以解决基因操作的各种需求和挑战。 此外，对于DNA双链断裂的基因毒性以及同源定向修复（HDR）低效率的担忧进一步推动了“第二代”CRISPR技术的发展，这些技术在不依赖于DNA双链断裂形成和HDR的情况下介导基因组编辑，其中最具代表性的是碱基编辑器（base editor，BE）和先导编辑器（prime editor，PE）。目前可用的CRISPR基因组编辑技术主要包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、碱基编辑、先导编辑、转录调控、RNA编辑，这为基因组编辑提供了更具针对性的方法，特定技术特别适合某些类型的编辑或递送模式。但虽然这些基因组编辑工具包的新增内容对解决与规范化CRISPR基因组编辑相关的许多限制做出了显著贡献，但它们在编辑活性、特异性和递送方面仍然存在一些限制。 过去十年，基因组编辑领域从一个新兴的科学追求转变为一种变革性的生物技术力量。第一代CRISPR技术主要基于内源性修复或位点特异性DNA双链断裂（DSB），已被第二代技术，例如碱基编辑和先导编辑所补充，这些技术可以在不产生DSB的情况下直接靶向DNA修饰，通常被认为更安全，并产生更可预测的编辑结果。新兴第三代CRISPR技术正在开发中，以解决该领域中两个主要未满足的需求：实现大片段DNA序列的精确插入，以及通过表观基因组工程实现在没有任何基因组编辑的情况下进行基因调控。这些和其他技术的持续进步是由两种方法实现的：一方面，通过挖掘宏基因组来发现新的分子系统，另一方面，通过合成生物学和人工智能支持的分子工程。 基因组编辑的现状最好地体现在不断扩展的新技术和方法的组合中，这些技术和方法主要基于源自CRISPR-Cas系统的RNA引导分子工具，彻底改变了我们精确和轻松地操纵遗传物质的能力。当前的发展趋势表明，这些技术将继续得到改进，在特异性、效率和传递机制方面逐步提高。值得进一步研究的领域将包括开发更具特异性和免疫原性的递送载体、减少脱靶效应以及增强对编辑结果的控制，从而提高基因组编辑的准确性和精度。展望未来，与纯粹基于蛋白质的技术相比，核酸引导系统可能仍然是基因组编辑的核心，因为它们具有简单的可编程性和适应性。然而，它们的应用模式可能会演变，可能会转向更瞬时性的编辑方法，以最小化意外长期基因变化的风险，或者通过瞬时递送来最小化基因组的破坏和免疫反应。 随着第一代CRISPR技术已经通过体外编辑被批准用于临床治疗镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血等疾病，以及体内基因编辑疗法的出现，限制未来广泛的基因组导向的治疗发展的瓶颈将不再是缺乏安全、高效或精确的基因组编辑器。主要挑战将在于递送方法，特别是对于血液和肝脏以外的器官以及某些体外细胞类型。体内递送方法的进步，例如mRNA疫苗开发中所见，可能会显著促进CRISPR技术的应用。此外，即使是目前可用的CRISPR方法编辑的组织和细胞，也需要更多的基础研究来确定安全的编辑靶点。因此，随着新传递载体的开发以及致病变异及其纠正策略的表征，可以通过CRISPR治疗的疾病范围将不断扩大。预计CRISPR领域外的进展将有助于推动这些技术向新的方向发展，增强其功能。在这种背景下，人工智能（AI）的兴起将使我们能够准确地模拟复杂的基因组编辑场景，预测靶向和非靶向编辑结果，并设计更强大的基因组编辑器，从而加快实施安全治疗方法的步伐。 伦理和社会影响，特别是涉及人类生殖细胞基因组修改的问题，将继续成为基因组编辑讨论的前沿。随着人类体细胞编辑成为现实，治疗性和非治疗性生殖细胞编辑的前景，以及对人类基因组进行可遗传改变的潜力，提出了深刻的伦理问题，全球社会必须加以解决。由于人类胚胎的研究表明，CRISPR基因组编辑技术在用于生殖目的的生殖细胞编辑方面不够安全或有效。此外，生殖细胞编辑的治疗效用有限，可能只对少数人有益。然而，对于基因组编辑技术的治理和负责任的管理，国际共识的紧迫性不能被夸大，特别是考虑到其快速发展、不断改进和广泛采用。 总的来说，尽管存在这样那样的挑战，但CRISPR基因编辑的未来是光明的。它不仅有潜力推动研究突破和革命人类医学，还有潜力提高农业生产和应对气候生态挑战，从而为子孙后代建立一个更健康、更可持续的未来。
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  • 《动物所开发出新型TnpB微型基因编辑工具》
    • 来源专题：生物育种
    • 编译者：季雪婧
    • 发布时间：2023-07-06
    •     CRISPR-Cas技术促进生物医学研究。除了广泛使用的Cas9系统之外，其他CRISPR亚型也不断被发现并应用于基因编辑，例如能够装载进AAV病毒的SaCas9（1053 aa）以及更小的微型CRISPR-Cas系统Cas12f（400~550 aa）。已发表的工作重建了CRISPR-Cas系统的起源，发现了原核转座子编码的IscB和TnpB蛋白分别是Cas9与Cas12核酸酶的祖先。这些祖先蛋白尺寸较小，但是否具备核酸酶活性缺乏证据；直到2021年，IscB和TnpB被发现在非编码RNA     （omegaRNA或reRNA）引导下切割双链DNA，证实了其与CRISPR-Cas系统相似的工作机制。TnpB由IS200/IS605等原核转座子家族编码，并被推测参与转座子的扩张。TnpB的分布非常广泛，在目前已知的基因组存在超过百万的拷贝；而此前研究只发现了一种在人类细胞中具有活性的TnpB核酸酶（ISDra2），且效率不高；因此，TnpB这一有潜力作为微型编辑工具的多样性宝库急需系统性的挖掘和研究。同时，由于可能推动转座子扩张，TnpB靶向切割DNA所依赖的关键元件（如reRNA）与转座子或存在关联，因而可以基于转座子信息进行预测，这将为工具的开发提供便利。     6月29日，中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院研究员王皓毅、博士项光海和动物所研究员张勇团队合作，在《自然-生物技术》（Nature Biotechnology）上，在线发表了题为Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors的研究论文。《自然-生物技术》同时发表了Research Briefing文章，对该成果进行总结和展望（Hypercompact genome editors are discovered by mining a transposon family）。该研究创新性地建立了对TnpB相关靶向基因编辑系统的大规模挖掘方法，并首次对多样性极其丰富的TnpB核酸酶进行了大规模挖掘，从而鉴定到33个在原核系统具有靶向编辑活性的TnpB蛋白，其中5个在真核系统具有活性。     研究对ISfinder原核转座子数据库中IS605编码的TnpB蛋白进行了全面的分析和挖掘，从64个候选项中鉴定出25种在大肠杆菌中活跃的系统，其中3种在人类细胞中具有基因编辑活性。该工作对功能数据的进一步分析揭示了TnpB蛋白相关的reRNA骨架与IS200/IS605转座子的RE序列具有完全重叠的3’末端，而TAM序列则与转座子上游的插入位点序列相同。研究表明，在TnpB系统中，与RNA介导的编辑器相关的三大要素（核酸酶、gRNA骨架和TAM序列）均可通过生物信息分析准确预测，这为大规模筛选高活性TnpB核酸酶奠定了基础。这一发现同时进一步确定了TnpB在IS605中的功能，即作为归巢核酸酶切割转座之后的原位点，从而诱导重组修复实现转座子的拷贝数扩增。 进一步，该团队从4个方面对TnpB相关的reRNA骨架进行了分析。结果表明：reRNA骨架在120-300nt的长度范围内均能够有效发挥功能，而120-140nt的reRNA骨架活性最强；reRNA骨架在3’末端的碱基对其功能有重要影响，单一碱基的突变即会显著降低编辑活性；靶向序列的长度在16-20nt为最佳；靠近TAM端的12nt是TnpB编辑器的核心序列。研究进一步整合分析了影响TnpB编辑器活性的潜在因素，发现了来自细菌的、由多拷贝转座子编码的、具有完整蛋白结构域和保守氨基酸的TnpB编辑器更为活跃。     该团队基于上述研究，建立了大规模挖掘全新TnpB基因编辑器的方法（如图），对部分未经转座子注释的原核基因组进行了从头注释和功能预测，并直接在人类细胞系中筛选获得了新的微型高活性TnpB编辑器ISAam1（369 aa）和ISYmu1（382 aa）。与其他微型Cas蛋白的平行比较发现，ISAam1和ISYmu1的活性与SaCas9相当，显著高于数种已报道的Cas12f蛋白及其变体。     综上，该研究建立了适用于TnpB编辑器的大规模筛选体系，进一步证明了TnpB在转座子扩张中的功能，并对这一类编辑器进行了系统的功能解析，从而获得了目前最小的具备原创知识产权的微型基因编辑器。考虑到体内基因治疗和细胞治疗经常因Cas蛋白过大而递送受限，这一成果将推动相关方面的研究和临床应用。     王皓毅致力于新型基因编辑工具的开发及CAR-T细胞治疗研究；张勇致力于转座子等机制介导的新重复基因的起源和进化研究。两个团队的合作推动了对TnpB的挖掘。研究工作得到科学技术部、中国科学院战略性先导科技专项、农业农村部和国家自然科学基金委员会等的支持。
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