《苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1的克隆及功能鉴定》

  • 来源专题:转基因技术
  • 编译者: Zhao
  • 发布时间:2017-01-23
  • 【目的】异三聚体G蛋白(Heterotrimeric G protein)作为植物生物体内重要的信号转导分子,在感受外界环境刺激、参与植物抗逆反应和跨膜信号转导等方面发挥着重要作用。克隆异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1,并在烟草中过量表达MdGPA1,对其进行生物学功能鉴定和生理指标分析,为多年生木本植物响应环境因子信号转导过程中的分子机理研究提供参考。【方法】本研究以‘嘎拉’苹果(Malus × domestica ‘Royal Gala’)为研究试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆获得MdGPA1。使用MEGA5.0构建GPA1物种间系统进化树;利用qRT-PCR方法检测该基因在苹果受非生物胁迫诱导表达及组织特异性表达情况。构建MdGPA1植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶片,比较干旱胁迫条件下野生型和转基因株系的表型与生理指标,验证MdGPA1在植物干旱胁迫条件下的生物学功能。【结果】克隆得到苹果异三聚体G蛋白α亚基基因MdGPA1(基因序列号:MDP0000881842),该基因长为1 173 bp,编码390个氨基酸。进化树分析表明MdGPA1与白梨PbGPA1亲缘关系最近,同源性最高。基因表达分析显示MdGPA1主要在叶片中表达,在根系中的表达量次之,在茎和果实中的表达量较低。定量分析表明,该基因参与干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫响应,在150 mmol·L-1NaCl、150 mmol·L-1甘露醇、10% PEG和4℃胁迫条件下表达量明显下调,在5% H2O2胁迫处理下表达量明显上调。在烟草中过量表达MdGPA1,发现MdGPA1转基因烟草表现出对干旱敏感的表型特征,其叶片鲜重、叶绿素含量以及脯氨酸含量明显低于野生型烟草。在地下部,MdGPA1转基因烟草同样表现出对干旱敏感的表型特征;其根系形态相比于野生型较小,干重也明显低于野生型。【结论】MdGPA1参与了植物感受外界环境刺激的过程,对干旱、低温和盐等非生物逆境胁迫都存在着不同程度的响应。在烟草中异源表达MdGPA1后,提高了烟草对干旱的敏感性,转基因烟草表现出不耐干旱的表型,受干旱胁迫比野生型烟草更为严重,说明MdGPA1在响应植物抗旱胁迫中起着负调控作用。

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  • 《Cell Rep: 新型免疫策略有助于诱导HIV-1膜蛋白三聚体广谱性中和抗体的产生》

    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2021-04-12
    • 长期以来,可溶性“ SOSIP”稳定化的包膜(Env)三聚体被认为是有前途的HIV疫苗免疫原。但是,它们会诱导针对无糖化的三聚体基底部结构域的高滴度反应,而在天然病毒中该表位往往是被“掩盖”的。为了描述针对融合肽(Fusion Peptide,FP)位点的免疫原引发的靶向基地结构域的免疫反应,来自美国NIH 的John R. Mascola团队定量研究了各种SOSIP稳定化的Env三聚体和FP载体免疫策略在诱导非人类灵长类动物产生针对Env三聚体基底结构域抗体的特征。 研究结果显示:靶向三聚体基底结构域的抗体反应在仅使用三聚体膜蛋白免疫的动物中约占90%,在用SOSIP三聚体和FP结合物联合免疫的动物中约70%,在FP初免-三聚体增强的策略免疫的动物中中约30%。值得注意的是,FP引发的动物的广谱中和抗体的产生水平与靶向三聚体基底结构域的抗体产生水平呈负相关。这些结果提供了量化分析抗体反应发生率的方法,并揭示了FP接种可以减少三聚体碱基反应并改善中和结果。 首先,作者选择了49只灵长类动物(NHP)进行研究,它们被分为8组,分别接受了3种不同类型的免疫原接种:1)三聚体,2)三聚体-FP,3)FP初免(prime)+三聚体增强(boost)。第一组三包括总共23只动物,它们在第0周和第4周接受三聚体免疫,并在第6周采集血浆样品进行分析。第一组的免疫原包括BG505 DS-SOSIP或CH505 DS-SOSIP脱聚糖变体,其中 a) . 在融合肽周围去除了三个聚糖(N230,N241和N611); b) . 四个聚糖(N88,N230,N241和N611)在融合肽附近去除; 或者 c) . 在CD4结合位点(CD4bs)附近去除了三个聚糖(N197,N276和N462)(天然CH505三聚体在CD4bs附近的N362缺失了聚糖)。 CH505 DS-SOSIP免疫原进一步被构建为嵌合体,其中gp120的N和C末端以及整个gp41亚基的部分被BG505的序列取代。结果显示,CH505和BG505免疫原接种后产生的针对基底结构域的抗体反应是相同。值得注意的是,此前研究仅对三聚体中的FP特异性反应的分析,但尚未发现针对基底结构域的特异性反应。 进一步,作者检测了针对Env三聚体基底结构域的特异性血浆抗体反应。研究结果显示,针对基底结构域的Fab能够阻断单克隆抗体或血浆抗体对基底结构域的识别,但不会影响广谱性中和型抗体(bNAb)对三聚体主要侵染位点的识别。 之后,作者发现在给受试动物接种FP(仅接种FP或与DS-SOSIP联合),均能够显著降低针对基底结构域的抗体的产生水平。此外,针对基底结构域的抗体反应程度以及广谱中和抗体的产生水平之间存在明显的负相关性。 综上,该研究揭示了不同的免疫策略对靶向基底结构域抗体产生水平的影响以及其对广谱中和抗体产生水平的影响,对于进一步开发针对HIV-1的广谱性中和抗体疫苗具有积极的意义。
  • 《Nature丨CD4结合HIV-1 Env异源三聚体的中间构象》

    • 来源专题:战略生物资源
    • 编译者:李康音
    • 发布时间:2023-11-25
    • 本文内容转载自“”微信公众号。原文链接:https://mp.weixin.qq.com/s/PXOP6p4TwV3ha2p036XMOg 2023年11月22日,加州理工学院的研究人员在Nature发表了题为Intermediate conformations of CD4-bound HIV-1 Env heterotrimers的文章。该研究为HIV-1包膜(Env)蛋白在结合不同数量的CD4受体时所采取的中间构象提供了宝贵的见解。 研究人员工程化了只能结合一个或两个CD4分子的Env异源三聚体,并确定了这些异源三聚体与CD4结合的冷冻电镜结构。研究人员发现,一个CD4受体的结合主要导致Env维持闭合的融合前构象。相比之下,两个CD4分子的结合导致了部分打开的、非对称的构象,其中两个gp120亚基采用CD4结合打开的构象,第三个gp120处于外翻但V1V2没有移位的隐蔽打开状态。值得注意的是,gp41构象与相应的gp120只有部分一致,这表明gp120和gp41的构象变化并非严格耦合的。 总之,这项研究拓宽了我们对Env在与CD4初期接触过程中构象动力学的视角,指出一个受体的结合一般不足以触发大规模Env重排。两个CD4分子结合的非对称中间态增进了对于gp120和gp41水平上的进入机制理解。稳定不同的构象中间体的能力为结构引导的干预和功能含义的审视提供了新的机会,增进了我们在结构水平上对HIV感染和病毒膜融合早期事件的理解。