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《RNA引导的核酸内切酶 - 原位标记（RGEN-ISL）：基于CRISPR / Cas9的快速方法，用于标记不同物种的基因组序列。》

  • 来源专题：实验室生物安全
  • 编译者： 张虎
  • 发布时间：2019-05-16

  • 可视化基因组的时空组织将提高我们对染色质结构和功能如何交织的理解。我们开发了一种工具，用于基于具有重组Cas9核酸内切酶复合物的两部分指导RNA可视化固定核和染色体中的确定的基因组序列。该方法不需要任何特殊的构造或转换方法。与经典荧光原位杂交相反，RGEN-ISL（RNA引导的核酸内切酶 - 原位标记）不需要DNA变性，因此可以更好地保留结构染色质。差异标记的反式激活crRNA的应用允许RGEN-ISL的多路复用。此外，该技术可与免疫组织化学结合。 CRISPR / Cas9介导的DNA标记过程的实时可视化揭示了反应的动力学。 RGEN-ISL对不同温度和方法组合的广泛适应性有可能推动染色体生物学领域的发展。

  • 原文来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30847946
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相关报告

  • 《基因魔剪CRISPR/Cas9新进展》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2018-03-20
    • CRISPR/Cas系统是从原核生物中发现的一种防御外源性遗传物质入侵的自身免疫机制，主要分为三种类型：Type I、Type II和Type III。而常用的CRISPR/Cas9系统是由II型改造而来，具有核酸酶活性，并能够通过向导RNA的作用靶向性结合生物基因组任何区域的目的基因，进而实现对目标基因的编辑。该系统最早被开发并最成熟的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)，它具有较高的切割活性和保真性，是目前研究最深入的Cas酶之一。它识别的序列需要临近3’端有一段序列，即PAM（protospacer adjacent motif）。经典的PAM是NGG，而非经典PAM序列是NAG（N指 A/T/C/G）【1，2】。 在哺乳动物细胞中，SpCas9对靶位点在PAM为NGG时编辑效率是NAG的15倍；而中国水稻研究所王克剑教授团队对水稻基因组进行编辑时，则发现SpCas9在NAG位点的编辑效率约为NGG位点的76.44%，且保真性更高【3】。笔者利用人类细胞对应的报告系统对16个不同的PAM序列进行筛选后发现，SpCas9在部分位点对PAM为NGA的有效切割效率分别是NGG、NAG位点的0.5倍和2倍【4】。这项研究显示野生型SpCas9在人类细胞中可以利用其他非经典的PAM，但是效率并不高，也提示挖掘适用范围更广的SpCas9是有可能的。 古诗云：“长江后浪推前浪，浮事新人换旧人。”同样，在CRISPR的“舞台”上更是新秀迭出。 2018年1月29日Nature Biotechnology 在线发表的文章A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast介绍了一种筛选SpCas9突变体的方法——酵母报告菌株筛选法。利用易错突变在SpCas9的REC3结构域处制造随机突变并构建突变体库，然后经酵母报告菌株（yACMO-off1–4）进行筛选并鉴别出较优突变体（图1）。研究者将筛选出的四个较优突变体进行组合突变，产生了最优突变体——evoCas9（evolved Cas9）。该突变体除了具有良好的靶向性和切割活性，它最突出的特点是超高的保真度，比之于野生型SpCas9提高了79倍【5】。鉴于此，evoCas9在基因编辑为基础的基因治疗方面将具有重要意义。 无独有偶，2018年2月28日Nature在线发表了Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity。在该项研究中，为了更快速获得理想的SpCas9突变体，David Liu团队使用了独门秘籍——PACE（phage-assisted continuous evolution）（图2，图3）。其实早在2011年，Nature 就刊登了David Liu 的另一篇文章A System for the continuous directed evolution of biomolecules，介绍了PACE定向进化技术【6】。该方法与以往在Cas酶编码基因序列中人为地制造突变，再利用原核/真核细胞进行功能筛选不同。PACE所使用的大肠杆菌含有诱导突变发生的质粒MP（mutagenesis）和激活后能表达PⅢ（噬菌体存活的必需基因）的质粒AP（accessory plasmid）。研究者们把需要突变的Cas酶蛋白编码基因序列放进噬菌体基因组，转染宿主大肠杆菌。PACE利用噬菌体繁殖周期短的特点，对Cas酶进行大批量、持续性的突变并定向筛选噬菌体。这项PACE技术通过把生物分子的实验室进化和噬菌体的生命周期结合在一起，一周内就能够实现成百上千次的传代变异，在诱变效率上比传统方法提高了100倍。 在PACE技术的助攻下，突变体CRISPR/xCas9 3.7的出现，如雨后春雷，给基因编辑的应用发展带来了历史性的变革。比之于SpCas9，由SpCas9进化而来的xCas9 3.7有着更多的潜力。第一，xCas9 3.7具有更灵活的PAM选择性，能识别更大范围的PAM序列，包括NGG、NG、GAA和GAT；第二，它具有更优的靶向转录激活性和更强的切割基因的能力；第三，新构建单碱基编辑器xCas9(3.7)–BE3能够对致病性突变位点进行C？G→T？A和A？T→G？C的碱基替换，其效率分别高达73%和71%，明显优于SpCas9–BE3；第四，xCas9 3.7表现出极强的特异性，在PAM为NGG的EMX1基因靶位点处甚至没有脱靶。但令人困惑不解的是，xCas9 3.7的PAM序列识别灵活性、酶活性和保真性同时得到优化的现象突破了以往三者之间存在某种制衡的概念。目前这项工作仍然留下了不少需要回答的问题。另外，文献里报道的这些突变体（包括之前报道的基于结构为基础的突变体，如eCas9）平行比较实验也需要进行，如此可让大家了解这些工具，更好地选择最合适的工具。 实现高效的单碱基编辑一直是研究者们孜孜以求的目标，David Liu实验室在2017年报道过一种应用于哺乳动物细胞新型的腺嘌呤碱基编辑器ABE，借此编辑器实现A？T→G？C的转变【7】，当然其编辑效率远低于xCas9(3.7)–BE3。而中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康研究组在水稻中开发了一种新的腺嘌呤碱基编辑器ABEP2，其识别靶位点依赖于SaCas9（PAM序列NNGRRT），能够对水稻基因组的多个目标基因位点同时进行高效的碱基替换，甚至某些位点的编辑效率达61.3%，而且ABEP2精确性也很高【8】。总之，单碱基编辑器对精准编辑目的基因的研究意义非凡，就目前而言xCas9(3.7)–BE3无疑是 “利器”。 随着不同国家、不同地域的研究者们在CRISPR领域孜孜探索，人类基因组编辑技术的发展日新月异，新的方法和工具层出不穷。我们希望研究者们能够解析xCas9 3.7活性、保真性、PAM序列灵活性三者能够同时得到优化的机制，相信在此基础上，会有更快速、简便、高效、精准的基因编辑技术出现，被更广泛应用于疾病诊疗上、动植物育种等方面。但是，现有的技术水平距离人类基因编辑的需求仍有一定的距离，而xCas9 3.7（由SpCas9进化而来）的出现犹如利刃出鞘，将会极大地促进基因组编辑领域的进程。 这里需要提及的是，多种各具特色的Cas9中，在体内有优势的是SaCas9 (staphylococcus aureus Cas9)。2015年张峰实验室首先确定了SaCas9在哺乳动物细胞中的基因编辑作用，并对晶体结构进行了详细的分析。它的基因长度为3300bp，比SpCas9减少了约25%，这有助于SaCas9被载入腺相关病毒（AAV），增加了基因治疗应用的潜力；它识别的PAM是NNGRRT（N指A、T、C、G；R指A、G），在切割活性和靶向精准度上的表现均不输于SpCas9【9，10】。笔者实验室建立了双报告系统来评估基因组编辑工具的活性和PAM【11】，分别检测SpCas9、SaCas9和FnCpf1在不同位点上的基因组编辑活性，经过多重比较得出结论——SaCas9拥有比SpCas9和FnCpf1更高的活性【12】。因此，SaCas9凭借其分子量小和活性高的特点，在基因编辑应用中占据优势，更为简便高效。关于SaCas9的工程化改造可能对于基因组编辑为基础的临床治疗有重大意义。 在功能基因组学上，CRISPR家族新成员Cpf1因为能够同时完成多个基因的编辑，所以优势很明显【13】。国际上较为广泛采用的AsCpfl和LbCpfl对PAM序列有较为苛刻的要求(TTTN)，极大程度上限制了Cpfl在实际应用中的靶位点的选择【14，15】。为了增加Cpf1靶序列的选择范围，笔者发现FnCpf1——其识别的PAM序列更加灵活（KYTV，K为G/T，Y为T/C，V为A/C/G），在人类细胞中具有较高的基因组编辑活性，这些为人类（含其他哺乳动物）基因组编辑提供了更多的工具【16】。如果能够进一步提高其保真性和活性，可能对于功能基因组学研究和临床疾病治疗非常有意义。另外，Cpf1家族对应的CrRNA较短，故而在工业化合成CrRNA方面更有优势。 综合上述，虽然xCas9 3.7的发现将让人类具有更加“锋利”和“通用性更强”的基因组编辑剪刀，但是它可能仍然无法做到基因组工具中“一统天下”，新的工具仍然需要研发和优化，从而实现“人定胜天”。
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  • 《Nucleic Acids Res：发现两种较小的新型Cas9核酸酶，有望更容易地进行基因组编辑》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2020-12-14
    • 在一项新的研究中，来自俄罗斯科学院、俄罗斯国家研究中心分子遗传学研究所和斯科尔科沃科学技术研究院等研究机构的研究人员描述了两种新的紧凑的Cas9核酸酶，即CRISPR-Cas系统具有切割活性的组分，这将有可能扩大Cas9工具箱在基因组编辑中的应用。这两种Cas9核酸酶中的一种被证实可以在人类细胞中发挥作用，因而可用于生物医学应用。相关研究结果发表在2020年12月2日的Nucleic Acids Research期刊上，论文标题为“PpCas9 from Pasteurella pneumotropica — a compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells”。论文通讯作者为俄罗斯国家研究中心分子遗传学研究所的Konstantin Severinov博士。 CRISPR-Cas是借用细菌的基因组编辑技术，它依赖于Cas核酸酶；这些酶在CRISPR RNA的引导下，可以降解目标基因序列---它们是“基因剪刀”中的刀片。在研究应用中，最受欢迎的Cas9核酸酶是酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9，即II-A型SpCas9。它的效率很高，而且相对简单，这是因为一个较大的蛋白既能结合crRNA，又能切割DNA；它还需要一个短的PAM序列---一串位于在靶位点两端的核苷酸，以便SpCas9用来定位和“读取”它。 但是SpCas9是一个较大的蛋白，当人们想使用腺相关病毒（AAV）颗粒作为载体将这种“基因剪刀”递送到细胞中时，这就会产生问题。理想情况下，人们希望将编码这种Cas蛋白的基因和向导RNA（gRNA）序列都装入一种病毒颗粒中，而这种尺寸限制需要较短的Cas9种类。然而，那些较短的核酸酶往往需要更长、更复杂的PAM，因此科学家们面临着蛋白大小和靶标选择之间的权衡。 在这篇论文中，最近通过斯科尔科沃科学技术研究院博士答辩的Iana Fedorova以及Severinov实验室研究员Aleksandra Vasileva及其同事们描述了两种新的小型Cas9核酸酶：一种来自Defluviimonas sp.20V17（一种生活在热液喷口的细菌），即DfCas9，另一种来自侵肺巴斯德菌（Pasteurella pneumotropica，一种在啮齿动物和其他哺乳动物中发现的常见细菌），即PpCas9。这两种核酸酶恰好对AAV载体来说足够小，并且具有相对较短的PAM，对于Cas9核酸酶来说，这是“两全其美”的选择。 这两种新的Cas9核酸酶与II-C型CRISPR-Cas系统有关，与SpCas9相比，通常表现为更小的Cas9效应物。这两种核酸酶采用了类似于其他Cas9蛋白的保守的双叶结构，但也有独特的特点：它们缺乏几个插入子结构域，并且有一个较小的Wedge结构域（负责与单向导RNA支架相互作用的结构域，因而更加紧凑。 Fedorova说，“事实上，II-C型Cas9效应物往往需要较长的PAM序列，但这只是基于迄今描述的有限数量的II-C型Cas9效应物的观察。例如，最近发现的来自耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）的Cas9（SauriCas9），与PpCas9类似，需要短的PAM（5'-NNGG-3'）。很可能很快就会发现更多需要短PAM的II-C型Cas9酶。这些具有不同PAM要求的小型Cas9蛋白扩大了真核和原核基因组中潜在的可编辑DNA靶点的数量。” 体外研究和在细菌中的实验表明，这两种Cas9核酸酶能高效地切割DNA，而且PpCas9核酸酶在人体细胞中也很活跃。这些结果也发现它们与其他已被证明在真核细胞中起作用的Cas9核酸酶-- Nme1Cas9和Nme2Cas9---非常相似。虽然还需要开展更多的研究来确定这两种Cas9核酸酶的效率，但是这些研究人员认为它们可能为微生物工程和生物医学基因组编辑中使用的更传统的核酸酶提供了一种可行的替代物。 Fedorova指出，对PpCas9脱靶编辑（非预期修饰）的初步研究表明，这种酶具有合理的特异性。但要证实PpCas9的特异性足以被视为一种基因组编辑工具，还需要使用更复杂的方法进行额外的研究。 她补充道，“此外，看起来PpCas9在靶向细胞中的不同基因方面表现出选择性。这可能会减少PpCas9可能的基因组靶点的范围，这种偏好性是一个值得进一步研究的课题。”
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