2024年5月22日，加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna通讯在Cell发表题为Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9的文章，报道了将耐热嗜热脂肪芽孢杆菌Cas9（Geobacillus stearothermophilus Cas9, GeoCas9）转化为有效的基因组编辑器的成果，提供了高效DNA靶向和切割的机制基础。
通过全面的结构和生物化学分析，研究人员揭示了楔形（wedge, WED）结构域在调节GeoCas9的基因组编辑能力中发挥的关键作用。冷冻电子显微镜（Cryo-EM）结构显示，工程iGeoCas9变体的WED结构域中的三个关键突变与DNA靶链和非靶链建立了新的相互作用。这些相互作用不仅增强了iGeoCas9与其DNA底物的结合亲和力，而且赋予了松弛的PAM（protospacer-adjacent motif）特异性，从而能够有效靶向更广泛的基因组序列。
这项研究揭示了iGeoCas9加速DNA解旋的能力。这种增强的DNA动力学补偿了哺乳动物细胞典型的显著损害了野生型GeoCas9的活性的镁限制性环境。荧光报告基因分析显示，即使在低镁浓度下，iGeoCas9也能快速通过中后期限速步骤R环形成。研究人员通过将WED结构域突变引入另一种Cas9同源物Nme2Cas9，进一步证明了他们合理工程方法的可转移性。工程化的iNme2Cas9变体表现出显著的基因组编辑效率，优于先前报道的通过连续进化方法工程化的Nme2Cas9变体。值得注意的是，与野生型酶相比，iNme2Cas9的编辑活性提高了100倍，突显了WED结构域工程的变革潜力。
总之，这项开创性的研究不仅阐明了iGeoCas9增强基因组编辑能力的结构和机制基础，还为CRISPR-Cas系统的合理工程制定了一般策略。通过关注WED结构域，一种以前未被重视的Cas9功能调节因子，研究人员揭示了一种开发更有效、更强大的基因组编辑器的简化方法。这一基本理解为开发下一代基于CRISPR的疗法铺平了道路。
