摘要:水稻白叶枯病是最重要的水稻细菌性病害，严重威胁水稻生产和粮食安全。培育和种植抗白叶枯病水稻新品种是控制该病害最经济、有效、环保的技术手段。W6023是本课题组早期通过普通野生稻与IR24杂交创制的抗病基因导入系，前期转录组测序结果显示，Pong2?1(Os02g20780)和Pong11?1(Os11g14160)在感病亲本IR24中激活表达，在抗病导入系W6023中不表达。Pong2?1和Pong11?1是水稻中Pong类转座子最相似的两成员，DNA同源性超过90%，但转录本却存在明显差异。为研究Pong2?1和Pong11?1是否与IR24的感病性相关，本研究利用CRISPR/Cas9系统定点突变IR24的Pong2?1和Pong11?1位点，获得了多个突变株系，毒力测试结果显示Pong2?1和Pong11?1突变后IR24的抗性得到一定提高，创制出6个抗白叶枯病水稻材料。
水稻白叶枯病菌收录于我国《进境植物检疫性有害生物名录》，是重要的检疫对象。Xoo从水稻叶片的叶尖或叶缘水孔处侵入，在细胞间隙增殖，随后进入维管束组织并利用维管束在植物体内转移扩散。Xoo在侵染水稻过程中，通过多种途径将数量众多的毒性因子分泌到胞外或者转运到宿主细胞内，例如III型分泌系统效应蛋白。这些毒性因子靶向多个水稻靶点，通过抑制植物防卫反应或攫取养分，达到利于病原菌增殖和传播的目的。例如，Xoo中类转录激活效应因子靶向的水稻感病基因主要是SWEET糖转运蛋白家族基因(包括OsSWEET11、Os?SWEET13和OsSWEET14)。Xoo引起水稻的白叶枯病，严重威胁到水稻生产和粮食安全。BB发生时一般会给水稻造成20%~30%的减产，严重情况下可达50%~60%，甚至绝产。
长期的生产实践证明，培育和利用水稻抗病品种是控制此病害最有效、最经济也是最环保的手段。但是随着病原物的不断进化和生态条件恶化带来的生物多样性减少，可利用的抗病育种资源愈来愈少。抗病基因挖掘多从已有抗病资源中获得，如野生稻资源、地方特色品种等，这些资源应用于育种需要通过不断杂交和回交才能将抗病基因整合到现代水稻品种中，所需时间长，且存在遗传累赘等利用困难现象。利用外源基因整合到受体品种基因组中即转基因育种也是一种获得优良性状的手段，但是外源基因在受体基因组的定点整合问题至今没有解决，而外源基因在受体基因组的随机插入不仅可能导致外源基因的表达在某些位点受阻，而且可能导致受体基因组的某些有益基因失活，因而降低了获得理想转基因个体的效率，以及目前的转基因植物常常面临生物安全问题等。
基因组编辑技术的问世，为创制生物资源及育种利用提供了新途径。目前，基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶、类转录激活效应因子核酸酶以及CRISPR/Cas9，3种编辑技术。ZFNs体系的构建难度较大、成本高，目前只成功应用于人类干细胞、大鼠、烟草等少数生物体的基因组编辑。在作物改良上，只有一例利用该技术对玉米性状进行改良的报道。与ZFNs相比，TALENs载体的构建相对简单、成本也大幅度降低，此技术迅速被应用起来。例如，利用该技术对感病水稻效应子结合元件位点进行突变达到了规避PthXo1、AvrXa7、Tal5、TalC等TALEs毒力的目的，使水稻感病品种产生了抗病的效果。继TALENs技术后，国际上又出现了基因组定点编辑的CRISPR/Cas9技术，该技术凭借着成本低廉、操作方便、效率高等优点，被迅速应用于人类、动物和植物等的基因组编辑。例如，F.Wang等针对稻瘟病负调控基因进行定点编辑，获得了稻瘟病抗性明显提高的水稻材料。M.Li等对水稻产量相关基因进行定点修饰，发现每穗实粒数、粒长都明显增加。Y.Wang等对水稻基因DEP1进行定点突变，突变后使水稻材料植株变矮，籽粒密度、产量增加。Y.Zhang等对小麦3个负调控同源基因TaEDR1进行定点编辑，提高了小麦对白粉病的抗性。J.Shi等对玉米一个乙烯响应的负调控因子ARGOS8进行编辑，在干旱条件下，突变体的抗旱性显著高于野生型。J.Li等对水稻OsEPSPS基因定点替换，获得的突变体对草甘膦具有抗性。目前，CRISPR/Cas9技术在农作物的各种性状改良上得到了广泛的应用。
本课题组前期对病原菌诱导下的IR24和野生稻基因导入系W6023进行了转录组测序分析，比较基因表达的差异，发现一个在W6023中几乎不表达而在感病供体IR24中高表达的基因Os02g20780和Os11g14160，推测这2个基因可能与感病相关。本研究旨在利用CRISPR/Cas9技术对IR24开展定点突变，检测定点编辑后的水稻材料是否产生抗病性。这一研究将对探讨水稻白叶枯病感病机理提供依据，也为水稻育种提供新的抗病资源。
1材料与方法
1.1供试水稻材料
本研究使用的水稻材料:水稻白叶枯病广谱感病品种IR24，野生稻基因导入系W6023，IR24的编辑植株。所有材料于2015年12月至2017年10月分别种植在海南三亚市南滨农场中国农业科学院作物科学研究所南繁基地和中国农业科学院作物科学研究所网室(北京)，常规水肥管理。
1.2供试菌株与接种方式
水稻白叶枯病菌代表菌株PXO99A接种前从-80°C冰箱取出，在PPS培养基28°C培养48h，以无菌水配制接种菌液，浓度调至OD600=1.0。幼苗期水稻材料(5~6叶)采用注射方法接种，收集样品、提取RNA用于基因表达分析。用于表型鉴定分析的水稻材料在成株期采用人工剪叶接种法接种鉴定，分别在接种后7d、15d进行调查。
1.3水稻DNA提取
采用S.R.McCouch等报道的酚/氯仿抽提法提取水稻基因组DNA。
1.4水稻RNA提取及反转录
水稻材料总RNA的提取采用Trizol法。取适量RNA用DNaseI(2270A，购自宝生物工程(大连)有限公司)消化残留的DNA后，使用RNA纯化试剂盒(DP412，购自天根生化科技(北京)有限公司)纯化。取2μg总RNA使用反转录试剂盒(KR106，购自天根生化科技(北京)有限公司)合成cDNA。
1.5基因克隆
根据日本晴基因组信息设计Pong2?1、Pong11?1克隆引物分别为Pong2?1F:ATGAATCCGACG?GAATCGAAGAAGCGTC;Pong2?1R:TCAATTATCTT?TAGCAAACAAAGCCAAT和Pong11?1F:ATGAATCT?GACGGAATCGAAGATGCGTC;Pong11?1R:CTATAG?TATTGAACTTTCTCTAAGATCA。PCR反应体系为20μL:2×PCRMasterMix10μL、正反向引物各1μL、cDNA模板1μL(35ng)、Nuclease?Free水补齐到20μL。反应程序为:95°C30s;95°C10s，52°C20s，72°C60s，40个循环。基因克隆及载体构建时采用高保真KODFX酶(Toyobo，日本)并测序，转基因植株阳性检测及基因剪切分析等用普通Taq酶扩增。
1.6水稻突变体的构建和检测
本研究构建IR24Pong转座子突变体时，采用华南农业大学刘耀光实验室提供的pYLCRISPR/Cas9Pubi?H载体，首先将接头引物(靶点1F:GGCACCGGCAGCCTGATTGGATT;靶点1R:AAA?CAATCCAATCAGGCTGCCGG;靶点2F:GCCGTCG?GCTCCCACAACACTAG;靶点2R:AAACCTAGTGT?TGTGGGAGCCGA)94°C加热30s，室温自然冷却退火，然后与对应的sgRNA载体连接，将含有不同靶位点的sgRNA通过PCR扩增形成含有多个靶位点的gRNA表达盒，详细步骤参见X.Ma等。本试验采用农杆菌介导的水稻遗传转化技术。
1.7亚细胞定位
用特异引物扩增基因编码序列，克隆到pCAM?BIA1205?YFP上，电击转入农杆菌EHA105中。30°C培养箱中过夜培养菌液，4000r/m离心收集菌体，缓冲液重悬菌体浓度调节到OD600=1.0，室温静止3h。采用1mL注射器吸取菌液，注射本氏烟叶片后，人工气候室培养2~3d。将注入菌液部分的叶片用手轻轻撕下，用荧光染料DAPI(特异性细胞核染色试剂)对本氏烟叶片进行染色处理。使用LSM7000激光共聚焦扫描显微镜(蔡司)观察蛋白在细胞中表达的位置。
2结果与分析
2.1Pong2?1、Pong11?1的转录表达分析
W6023经过多轮回交后在遗传背景上与IR24很接近，为了探究W6023与IR24水稻白叶枯病抗性差异原因，本实验室前期通过RNA?Seq分析了在PXO99A诱导情况下的两个材料转录组之间的差异。结果显示，Pong类转座子成员Os02g20780(Pong2?1)和Os11g14160(Pong11?1)在IR24中均有表达，但是在W6023中几乎没有表达。为了验证转录组测序的结果，本研究通过RT?PCR检测了Pong2?1和Pong11?1的表达情况，结果表明RT?PCR和RNA?Seq分析结果一致(图1)。
依据日本晴基因组信息，水稻携带有超过100个Pong类转座子成员。在DNA水平上Pong2?1和Pong11?1是最接近的两个成员，序列同源性超过90%(结果未显示)。由于Pong2?1和Pong11?1间存在单核苷酸多态性，基因组预测Pong2?1和Pong11?1的RNA剪接形式存在差异(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。为了明确这两个Pong类转座子成员转录本的真实情况，尝试克隆日本晴、IR24和W6023的Pong2?1与Pong11?1的cDNA并测序(图1)，结果显示Pong2?1、Pong11?1在日本晴和W6023中均未检测到有表达，但在IR24中有表达并表现为不同的两种剪接体形式。
2.2Pong11?1的序列分析与亚细胞定位
克隆得到Pong2?1、Pong11?1全长cDNA后，测序分析发现Pong2?1编码190个氨基酸，Pong11?1则编码一个398个氨基酸的蛋白。二者与日本晴的序列也存在一定差异，差异的原因是SNP导致两种剪接体形式不同。为了研究Pong类转座子蛋白在细胞中的定位，选取Pong11?1作为研究对象。克隆Pong11?1全长cDNA，连接到pCAMBIA1205?YFP载体后转化农杆菌GV3101。通过注射烟草，利用农杆菌瞬时表达系统，激光共聚焦显微镜观察到融合蛋白在细胞中的位置，如图2A~D显示YFP?Pong11?1在本氏烟叶片表皮细胞的细胞核中表达。H为空载体YFP的定位结果，其表达分布在整个下表皮细胞(图2E~G)。通过烟草瞬时表达系统表明Pong11?1编码一个核蛋白。
2.3基因编辑载体构建及遗传转化
由于发现Pong2?1、Pong11?1仅在IR24中表达，为了验证其表达是否对水稻感病起作用，利用CRISPR/Cas9系统对IR24中的Pong2?1、Pong11?1进行定点突变。由于Pong2?1、Pong11?1DNA同源性高，设计了针对这两个基因的共同gDNA(图3)，选择了2个靶位点(图3A)。参照X.Ma等的方法构建成含有双靶位点的CRISPR表达载体pCponT12(图3B)。
2.4T0代转基因植株的PCR检测
将上述CRISPR/Cas9载体pCponT12通过农杆菌介导法转入IR24的愈伤组织中，经筛选分化获得20个T0代植株，种植于海南试验基地。为了验证其是否为真正的转基因植株，根据Cas9基因DNA的序列，设计了一对基因特异引物Cas9pF/Cas9pR(Cas9PF:TTCGACCAGTCCAAGAACGG，Cas9pR:CTT?GACCTTGGTGAGCTCGT)，对上述20株的DNA进行PCR扩增。20株转化体都能扩增出531bp的DNA特异性条带，而阴性对照IR24无扩增条带(图4)。结果表明20株转基因植株全部为阳性植株。
2.5编辑植株的基因型鉴定及抗性检测
随机选取部分T1代进行Pong2?1、Pong11?1位点基因型鉴定，测序结果显示，在5个T1代群体中，检测到在Pong2?1、Pong11?1位点发生编辑突变的植株，而且都是双靶点突变，大部分植株的突变位点基因型已纯合，5个群体中共检测到6种编辑类型如图5。对这6种编辑类型的植株进行了白叶枯病抗性测定，选取的测试菌株为PXO99A。接种15d后调查，每个编辑类型选取5株，每株选取3个叶片，进行调查统计。6种编辑类型植株病斑平均长度在6.94~8.71cm之间，而IR24发病长度为14.85cm(图6)。结果表明Pong2?1、Pong11?1编辑植株对水稻白叶枯病菌(PXO99A)表现出一定程度的抗性增强。
2.6Cas9?free编辑植株的获得与农艺性状考察
为了获取可利用的Cas9?free水稻抗性资源，利用Cas9基因特异引物Cas9pF/Cas9pR检测6种编辑类型的T2代单株，从中选取PCR检测阴性植株作为后续试验研究材料(图7)。田间再次接种试验显示接种7d后，IR24平均发病长度为2.81cm，而Z223、Z229、Z235和Z255平均发病长度分别为0.67cm、0.88cm、0.69cm和0.75cm。接种15d后病斑有扩展，IR24发病长度为15cm，而Z223、Z229、Z235和Z255平均发病长度分别为7.51cm、8.69cm、7.34cm和8.31cm(图8A、B)，可见编辑植株病斑长度仍显著小于IR24的病斑长度。
为了研究编辑植株主要农艺性状是否发生改变，对上述4个Cas9?freeT2纯合株系的主要农艺性状进行了考察。从表1可看出，4个材料的株高、分蘖数、结实率和千粒重与野生型对照(IR24)基本一致;4个材料的T检验分析结果显示上述农艺性状与野生型对照无显著性差异。基因被编辑后对水稻的主要农艺性状无显著影响，最终本研究获得了白叶枯病抗性提高、Cas9?free及农艺性状基本一致的种质材料。
3讨论
植物———病原物之间的斗争是寄主与病原菌协调进化的过程，植物病原物为自身的生存和发展会利用多种手段侵入寄主并攫取养分，造成植物病害的发生，而寄主植物主要利用自身的先天免疫系统应对不断变化的病原菌。植物的先天免疫系统可以分为两个层次，PTI和ETI。PTI主要是植物模式识别受体识别某些保守的病原物模式分子，例如FLS可以识别细菌鞭毛蛋白的保守短肽，诱导防卫反应产生，限制病原物的入侵。为成功侵染寄主，植物病原物会利用各种效应分子来抑制PTI，例如Xoo来源的T3SS效应分子XopY通过抑制OsCERK1对OsRLCK185的磷酸化阻止了PTI的信号转导。同时寄主植物也会进化出R基因监控、识别病原菌某些效应蛋白，一旦被识别即会触发强烈的免疫反应ETI，例如Xa23基因通过启动子EBE区识别Xoo的TALEAvrXa23蛋白，作物抗病育种利用的也大多是这类R基因，植物———病原物互作的特点决定了植物抗病育种是一项没有终点的工作。
现阶段挖掘得到的和已被利用的白叶枯病抗病基因有很多，例如Xa3、Xa4、xa5、Xa21和Xa23等，但由于R基因的不合理使用和病原菌的高速进化，一些优秀抗病基因在生产上逐步丧失作用。粳稻大多利用的Xa3基因，在孟加拉、印度、尼泊尔、印度尼西亚、韩国及中国的南方等地区，含有Xa3基因的品种遭受到病原菌的危害。章琦研究表明，大面积种植的籼型杂交稻中主要应用了抗白叶枯病基因为Xa4，曾使白叶枯病得到了有效的控制。但到20世纪80年代中期，在中国南方各稻区及印度、印度尼西亚、韩国、尼泊尔等国也相继发生了携有Xa4基因的品种抗性逐渐丧失的报道。Xa21基因自鉴定克隆以来，由于各国争相利用在一些国家和地区如韩国、印度尼西亚、印度、中国的广东、云南等地发现能使携Xa21基因的宿主致病的菌系。夏立琼等发现的海南Xoo菌株优势致病类型对携带xa5、Xa23基因以外的材料都致病。因此育种家对水稻白叶枯病抗性资源的需求越来越迫切，挖掘和创制新抗病资源依旧是水稻白叶枯病防治工作重要的方面。基因组编辑技术的问世为创制基因资源提供了新途径，尤其是CRISPR/Cas9系统具有简单、高效、低成本的特点，在人类、动物和植物上得到了广泛的应用。例如，用该技术对水稻、小麦、玉米、柑橘等某些负调控基因进行了基因编辑，这些性状在不同程度上得到了改良，获得了抗病、抗逆性材料。
为了充分利用W6023这一抗病资源和研究其抗病特征，前期研究采用强致病菌PXO99A接种处理IR24和W6023后，对不同时间点的样品进行转录组测序，分析在不同致病表型下IR24和W6023材料表达差异。RNA?Seq发现Pong类转座子在感病品种IR24中激活表达，但在野生稻导入系W6023中不表达。有研究发现玉米Pong类转座子在体外培养或者某种压力下会被激活表达，并且被认为对玉米基因组的进化起到贡献。我们推测Pong类转座子可能与IR24的感病性有关联，IR24是对多种病原物均感病，包括水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和水稻稻瘟病菌;与野生稻03?66杂交后，导入系W6023抗性明显增强，Pong类转座子的两个成员也不再表达，暗示病原菌胁迫解除后该类转座子转录被抑制，W6023基因组趋于稳定。由于Pong2?1和Pong11?1在IR24中高表达，本研究采用CRISPR/Cas9技术对IR24的Pong2?1和Pong11?1进行了敲除，获得了多个纯合株系，田间接种试验显示基因编辑株系的抗性得到不同程度的提高，编辑后的主要农艺性状无显著影响，最终获得了白叶枯病抗性提高、Cas9?free及农艺性状基本一致的种质材料。但IR24抗病性差是否与基因组稳定性有联系，Pong转座子的表达是否增加了IR24的感病性，还需开展更深入的研究。
来源：《植物遗传资源学报》2018，19(3):523?530
