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《噬菌体基因组中二氨基嘌呤取代腺嘌呤的广泛途径》

  • 来源专题：转基因生物新品种培育
  • 编译者： 王晶静
  • 发布时间：2021-05-28

  • 四个碱基。腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）通常被认为在DNA中是不变的。然而，在细菌病毒中，每个DNA碱基都有变异，帮助它们逃脱细菌限制性内切酶的降解。在噬藻体S-2L的基因组中，腺嘌呤（A）完全被二氨基嘌呤（Z）所取代，二氨基嘌呤（Z）与胸腺嘧啶（T）形成三个氢键，从而在该病毒的DNA中形成non–Watson-Crick碱基配对（请参见Grome和Isaacs的观点）。Zhou et al.和Sleiman et al.确定了产生Z的生化途径，从而揭示了宿主环境中广泛分布的细菌中携带的病毒中更多的Z基因组。Pezo等人发现了一种DNA聚合酶，将Z整合到DNA中，而拒绝了A。这些发现丰富了我们对生物多样性的理解，并扩大了合成生物学的基因面板。

  • 原文来源：https://science.sciencemag.org/content/372/6541/512
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  • 《噬菌体疗法：精准打击土传病原菌》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2023-02-09
    • 　利用噬菌体阻控病原细菌的手段被称为“噬菌体疗法”，这是一种有望替代抗生素的绿色生态技术。目前，国内已有研究单位针对不同的植物病害收集了大量的噬菌体资源，研究不同噬菌体的作用机制，以及噬菌体之间的相互影响，利用不同噬菌体联合抑制土壤病原细菌。 　　噬菌体，是专门“吃”细菌的一类病毒，它们广泛存在于海洋和陆地自然生态系统中。噬菌体通过侵染宿主细菌，可以调控细菌种群数量，驱动细菌群落多样性和组成的变化，进而影响生态系统功能。 　　但长久以来，土壤中的噬菌体与作物土传病害的关系还鲜有研究。 　　近日，国际学术期刊《微生物组》在线发表了中国工程院院士、南京农业大学资源与环境科学学院教授沈其荣团队的最新研究论文。该团队研究发现，土传青枯病的发生，与作物根际噬菌体群落构成及噬菌体—宿主细菌的互作特征密切相关。该研究首次证明特异性侵染土著细菌的噬菌体，对土传病原细菌青枯菌入侵的潜在影响，为利用噬菌体消减青枯菌导致的作物土传青枯病提供了新的理论基础。 　　靶向消灭病原细菌，对环境更友好 　　在农业生产中，化学农药和抗生素已被广泛使用，但不合理的使用会造成土壤功能退化、环境污染等问题。 　　“例如，化学农药的滥用会显著增加病原细菌的耐药性和抗性基因的风险传播。此外，在病原细菌与其宿主植物互作的热点区还存在大量土著微生物，这些微生物通过复杂的协同互作，在抵御病原细菌侵入和感染宿主植物中发挥重要作用。然而，广谱杀菌的抗生素和化学农药等在抑制病原细菌的同时，也会破坏土壤中土著微生物群落的结构和功能稳定。”沈其荣介绍，要护卫土壤、动植物、环境健康，亟须有效靶向消灭土传病原细菌并对环境友好的新措施。 　　噬菌体，便是其中的“天选之子”。噬菌体是专门侵染细菌的一类病毒，在环境中普遍存在，“目前地球生物圈中噬菌体的数量高达10^31个。利用噬菌体阻控病原细菌的手段被称为‘噬菌体疗法’，这是一种有望替代抗生素的绿色生态技术。”论文共同通讯作者、南京农业大学教授韦中告诉科技日报记者。 　　目前，噬菌体疗法已广泛应用于临床医疗、畜牧业、水产养殖和种植业等领域。 　　韦中介绍，噬菌体疗法具有几大优势：噬菌体可以识别特定病原细菌，对环境影响小；噬菌体可以利用宿主进行增殖，并进入细菌体内，高效裂解病原细菌；噬菌体疗法的应用可以减少抗生素的使用，为食品安全提供保障。 　　打造噬菌体“鸡尾酒”，守护植物健康 　　“在抗生素普及前，噬菌体疗法已经有了应用。”韦中所言非虚。自噬菌体被发现以来，噬菌体疗法不断发展，在解决由病原细菌侵染引起的作物健康问题方面已有不少尝试。 　　1924年，研究人员发现白菜滤液中的噬菌体类物质能够防止由黄单胞菌引起的白菜腐烂。随后， 该物质又被广泛应用于防治由青枯菌、欧文氏菌、丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌等引起的茄科作物青枯病、猕猴桃细菌性溃疡病、果树火疫病、柑橘斑点病、水稻叶枯病以及土豆洋葱软腐病和黑胫病等。2005年，美国环境保护局首次批准了防治由野油菜黄单胞菌和丁香假单胞菌引起的番茄和辣椒的细菌斑点病的噬菌体产品。2011年，美国环境保护局批准一家公司生产的噬菌体生物农药用于防治番茄的溃疡病。 　　目前，国内已有研究单位针对不同的植物病害收集了大量的噬菌体资源，这些噬菌体为有效防控病害提供了资源保障。 　　沈其荣研究团队将目标对准青枯菌。青枯菌在土壤中可通过侵染作物根部，引起烟草、马铃薯、番茄、生姜等重要经济植物的萎蔫。严重时，可导致作物大面积减产甚至绝收。 　　“青枯菌的专性噬菌体以青枯菌为食，它们可以进入青枯菌体内，进行大量增殖，并最终裂解杀死青枯菌。而土壤中还有很多土著细菌，这些细菌也有各自的‘专属’噬菌体。当青枯菌被其专性噬菌体抑制后，土壤中的其他细菌会纷纷‘占位’，细菌之间会上演一场此消彼长的攻防战。”韦中说，团队在此次研究中发现，土壤中的土著细菌，有的是青枯菌的“帮手”，有的则是青枯菌的“敌人”，这些土著细菌与其专性噬菌体互作也能间接影响植物健康。例如，一些土著细菌可以抑制青枯菌“作孽”，而其专性噬菌体的侵染压制，使它们的力量削弱，导致青枯菌更加猖狂，从而加剧病害。不同的噬菌体在土壤中像“鸡尾酒”那样混搭存在，影响着植物健康。 　　“这启发我们，可以充分挖掘土壤噬菌体资源，研究不同噬菌体的作用机制，以及噬菌体之间的相互影响，利用不同噬菌体联合抑制土壤病原细菌。”韦中解释。 　　新技术赋能，噬菌体疗法或可增强威力 　　与广谱抑菌的抗生素相比，噬菌体疗法有很强的专一性，能精准靶向某一类病原细菌。不过，噬菌体疗法也面临着一些技术挑战。 　　“与使用抗生素类似，噬菌体疗法也会不可避免地诱导靶细菌产生抗性。而且病原细菌在不断变异，抗性也会随之发生变化。这需要针对不同特点的病原细菌作研究，不断筛选噬菌体，进行精准治疗。”韦中说。 　　除了天然的噬菌体侵染阻碍物外，细菌也进化出一系列的抗噬菌体系统，来阻止噬菌体的侵染。因此，应用单一噬菌体往往无法有效抑制环境中多样的病原细菌，要有针对不同病原细菌的噬菌体配方。 　　纵然病原细菌有千般面孔，可以“七十二”变，但“魔高一尺，道高一丈”。韦中表示，目前科研人员正尝试多种方式抑制病原细菌作恶。 　　“首先是建立噬菌体资源库。近年来我们团队建立了全国土传青枯菌专性噬菌体资源库。库里包含了我们从全国收集的几千株青枯菌与五六百个青枯菌专性噬菌体。”韦中说，有了资源库，就可以结合培养组学、实验进化学、机器学习等，构建基因组预测噬菌体抗性的模型，选择能够侵染不同病原细菌或同一病原细菌的不同抗性突变体的噬菌体，配置噬菌体“鸡尾酒”配方，将不同的噬菌体组合，有针对性地杀灭病原细菌。 　　“其次，随着合成生物学的发展和对噬菌体侵染机制了解的不断深入，可以通过基因编辑定向改造噬菌体，如改变、扩大噬菌体的宿主范围以及增强噬菌体的裂解效率等。”韦中说。 　　人工智能也为提高噬菌体的有效性提供了更多可能。韦中认为，每个病原细菌的变异有限，人工智能可以在积累大量的实验数据和机器学习后，判断病原细菌基因突变的可能性及致病性的大小，并据此筛选、设计相应的噬菌体。 　　“尽管噬菌体疗法还面临诸多技术挑战，但发挥其优化微生态的优势是解决土壤病原细菌危害，提升土壤—植物系统健康的重要路径之一。”沈其荣表示。
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  • 《王艳丽组揭示噬菌体防御CRISPR-SpyCas9的分子机制》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：huangcui
    • 发布时间：2019-01-08
    • 2018年12月31日，《Molecular Cell》杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所王艳丽课题组在CRISPR-Cas系统取得的最新研究进展。标题为“Phage AcrIIA2 DNA Mimicry: Structural Basis of the CRISPR and Anti-CRISPR Arms Race”。该研究工作成功解析了Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2与Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) 蛋白及single-guide RNA (sgRNA) 的三元复合物3.3 埃的晶体结构，并结合体内和体外的功能实验，系统地阐述了噬菌体运用Anti-CRISPR 蛋白防御CRISPR-SpyCas9系统的分子机制。王艳丽课题组一直致力于CRISPR-Cas系统抗病毒作用机理的研究，前期研究揭示了一系列重要的CRISPR-Cas系统的作用机理 (Nature 2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol. Cell 2017, Cell 2018)；该工作是王艳丽课题组首次在Anti-CRISPR蛋白防御CRISPR-Cas系统作用机理的研究上取得的重大突破。　　CRISPR/Cas系统是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。CRISPR-Cas系统划分为两大类，第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能；第二大类是由单个效应蛋白（如Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13等）来发挥功能。其中，Cas9, Cas12a, Cas12b均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性, Cas13a具有RNA介导的RNA核酸酶活性。面对细菌的免疫系统（CRISPR-Cas），噬菌体也相应的进化出了自己的防御系统（Anti-CRISPR）。2017年首次发现了Listeria monocytogenes 噬菌体来源的四个Anti-CRISPR蛋白，AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 和AcrIIA4。研究发现AcrIIA2和AcrIIA4蛋白在细胞内能够抑制SpyCas9的基因编辑活性。随后的结构和功能研究表明AcrIIA4通过阻断DNA与SpyCas9的结合来抑制SpyCas9的功能，然而AcrIIA2抑制SpyCas9活性的分子机制一直未能阐述清楚。　　在该研究中，研究人员首先通过生化实验发现AcrIIA2只与结合有sgRNA的SpyCas9二元复合物结合，并不与自由状态下的SpyCas9结合，也并不与同时结合有sgRNA和dsDNA的SpyCas9三元复合物结合。为了研究AcrIIA2直接抑制SpyCas9活性的分子机制，研究人员利用X-ray晶体学的方法成功解析了AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA的三元复合物晶体结构 （3.3 埃）。结构发现AcrIIA2是由三个α螺旋及一个β折叠组成的紧凑结构，它结合在SpyCas9的一个带正电荷的凹槽区域。该区域由PI, HNH, WED, 和 REC2 结构域形成。PI结构域上R1333和R1335是识别dsDNA的PAM序列的关键氨基酸，AcrIIA2通过与R1333和R1335形成稳固的氢键从而阻断SpyCas9对PAM序列的识别，进而阻止SpyCas9对dsDNA的结合。而AcrIIA2的α1螺旋与HNH结构域的相互作用可以锚定HNH结构域，阻止其结合DNA必须发生的构象变化。另外，通过结构比对分析发现AcrIIA2有大量的带负电荷的氨基酸占据着dsDNA中PAM结合的位置，这表明AcrIIA2模拟带负电荷的DNA与SpyCas9结合从而阻止DNA与SpyCas9的结合。有趣的是，竞争性结合实验表明AcrIIA2并不能取代已经与SpyCas9-sgRNA结合的dsDNA, 而dsDNA也不能取代已经与SpyCas9-sgRNA结合的AcrIIA2。总之，通过结构和功能实验的证明，AcrIIA2主要通过三个步骤来抑制dsDNA的结合。首先，AcrIIA2可以阻断PAM的识别；其次，AcrIIA2占据了dsDNA的结合位点；最后，AcrIIA2通过限制HNH结构域的构象变化来抑制dsDNA的结合。　　目前，SpyCas9蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用于DNA领域的基因编辑，克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点，以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求，并有着潜在的临床应用价值。但是CRISPR-SpyCas9基因编辑系统也存在着一定的脱靶问题，该研究对Anti-CRISPR 蛋白抑制SpyCas9活性分子机制的阐述为控制或终止SpyCas9活性提供了新的参考和思路。有望将Anti-CRISPR 蛋白开发成新的基因编辑终止工具，实现精准基因编辑。　　中国科学院生物物理所王艳丽研究员为本文的通讯作者。王艳丽课题组的刘亮为本文的第一作者，该研究得到科技部、国家自然科学基金以及中国科学院战略性先导科技专项（B类）的资助，上海同步辐射光源（SSRF）以及日本同步辐射光源SPring-8为该研究提供了重要的技术支持。　　图注：AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA三元复合物的晶体结构　　（A）SpyCas9的结构域。　　（B）AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA三元复合物的结构展示图。
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