2017 年 1 月 31 日，北京生命科学研究所陈婷实验室在《PNAS》在线发表了题为 “Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model” 的研究论文。该研究首次利用体外成熟的 Cas9/sgRNA 核糖蛋白复合物在病人特异性的隐性营养不良性大疱性表皮松解症（Recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB）小鼠表皮干细胞实现了成体基因修复，从而为 RDEB 疾病以及其它遗传性皮肤疾病的治愈提供了全新方案。
隐性营养不良性大疱性表皮松解症是由皮肤中 VII 型胶原（Collagen VII）蛋白功能异常引起的隐性皮肤遗传病。在正常皮肤中，表皮角化细胞（Keratinocyte）与真皮中的成纤维细胞 (Fibroblast) 分泌的 Collagen VII 首先形成同源三聚体，然后组装成锚原纤维（anchoring fibrils），从而使得表皮与真皮牢固结合。在 RDEB 病人体内，Col7a1 基因中一些突变使得 VII 型胶原功能异常，从而导致表皮与真皮的脱离，产生血疱。基因治疗是唯一可以根治此类疾病的治疗方法。CRISPR/Cas9 系统是一种高效的基因编辑系统，近年来逐渐用来治疗一些以前毫无根治方法的遗传疾病。但，高效的体内导入 CRISPR/Cas9 的转运系统一直制约着这种技术向临床的应用。
为探索利用 CRISPR/Cas9 系统实现成体基因编辑从而治愈 RDEB 疾病，陈婷实验室研究人员首先建立病人特异性地 RDEB 小鼠模型。突变纯合体（Col7a1 c.6485G>A mut/mut）小鼠在出生后出现与病人相似的血疱表型。而杂合型（Col7a1 c.6485G>A wt/mut）小鼠皮肤完整，没有出现任何病症。组织切片结果显示在出现血疱位置的皮肤，表皮与真皮层相分离。即使在没有出现血疱的背部皮肤以及尾巴上的皮肤，表皮与真皮连接松散，也呈现出表皮与真皮分离的表型。Collagen VII 免疫荧光染色结果显示，在野生型老鼠皮肤 Collagen VII 呈线性分布在表皮与真皮之间的基底层位置。而在突变纯合体中，Collagen VII 蛋白则弥散分布在表皮的基底层细胞（Basal cells）以及靠近基底层的真皮层细胞中。
Collagen VII 蛋白按照其结构特征，可分为 N 端 NC1、位于中部的中部螺旋结构域（central helical region）以及 C 端 NC2 结构域。其中中部螺旋结构域在蛋白质一维结构上由许许多多 “Gly-X-Y” 重复序列构成。理论上，将含有突变的第 80 位外显子进行切除后，只会导致 Collagen VII 蛋白在长度上稍微缩短，而不会对其蛋白功能造成影响。为了验证第 80 位外显子切除是否安全，研究人员再一次通过 CRISPR/Cas9 系统介导的 NHEJ 细胞修复途径制作了第 80 位外显子转录缺失小鼠（Col7a1 ΔExon80）。杂合以及纯和突变小鼠与野生型小鼠表型一致，新生鼠与成年鼠都没有 RDEB 疾病的血疱表型。Collagen VII 蛋白无论是在突变杂合体还是纯合体中都呈线性分布在基底层位置。组织切片也显示突变杂合体与纯合体小鼠皮肤组织结构完整，表皮与真皮连接完好。研究人员接下来筛选出能够特异、高效地介导第 80 位外显子切除的 sgRNAs，并在体外表皮干细胞系中验证了 sgRNA 能够成功介导第 80 位外显子切除。
随后，研究人员建立了通过电击介导的 Cas9/sgRNA 核糖蛋白复合物皮内导入系统。为了准确、严谨地证明 CRISPR/Cas9 系统转运到皮肤细胞内并且能够正常发挥其功能，研究人员用表达 Cas9 蛋白以及两个特异性识别 Flox 位点的 sgRNA 的质粒通过电击的方法导入皮肤细胞来激活 Rosa26-stop-tdTomato 小鼠尾部皮肤细胞，发现几乎所有的 RFP + 细胞分布在已分化的角质细胞中。当将质粒替换成 Cas9/sgRNA Ai14-L/R 核糖蛋白复合物时， Cas9/sgRNA 核糖蛋白复合物不但能够转运到已分化的角质细胞中，同样可以高效的转运到基底层细胞中。通过长时间的跟踪观察。研究人员证实 RFP + 基底层细胞不但可以随着时间进行扩增，而且可以分化成表皮层细胞。
为了证明 Cas9/sgRNA 核糖蛋白复合物在小鼠体内对 Col7a1 基因进行了外显子切除，并且合成了 80 位外显子缺失的 mRNA，研究人员在 Col7a1 c.6485G>A mut/mut, Rosa26-stop-tdTomato fl/wt 小鼠中，利用 Cas9/sgRNA（sgRNA col7a1-L/R, sgRNA-Ai14-L/R）核糖蛋白复合物进行 Col7a1 第 80 位外显子切除同时激活 Ai14 细胞。在富集 RFP + 细胞中，研究人员在小鼠体内成功检测到了基因组 DNA 以及 mRNA 编辑之后的产物，并且通过测序进行了验证。更为重要的是，研究人员对修复后的小鼠皮肤中 Collagen VII 进行了免疫荧光染色的分析。一旦进行一次皮内注射 Cas9/sgRNA-col7a1-L/R 核糖蛋白复合物并进行电击后，Collagen VII 蛋白在基底层处分布明显增多。另外，在经过基因修复后的 col7a1 c.6485G>A-mut/mut 小鼠中，表皮与真皮粘附比例从~ 30% 上升到~ 60%。
综上所述，Cas9/sgRNA 核糖蛋白复合物能够通过电击介导体内 Col7a1 基因的编辑，从而，恢复 Collagen VII 蛋白功能，并且，修复 RDEB 表型。
北京大学 - 清华大学 - 北京生命科学研究所（PTN）联合培养项目吴文波为本文第一作者；其他作者包括陈婷实验室博士生陆智伟、李飞、钱南南、技术员王文洁、张昱实验室博士生段金志；该论文的其他作者还包括我所张昱博士，转基因中心的王凤超博士；陈婷博士为本文通讯作者。该研究由北京市科学技术委员会、科技部 973 项目资助，在北京生命科学研究所完成。
