我们的研究小组报告了第一个可逆反应的基于反应性的probe-ThiolQuant green，它可以量化2015年活细胞中的谷胱甘肽(GSH)水平。在这项工作的基础上，我们开发了第二代探针，RealThiol (RT)，它有很大的改进反应动力学、量子产量和溶解性，能够实时监测生活细胞中GSH水平的变化。最近，我们开发了一种线粒体特异性的GSH探针，MitoRT，可以监测线粒体GSH (mGSH) dynamics3。RT和MitoRT探测器对redox生物群落产生了极大的兴趣，并通过协作或kerafast.com与全球40多个实验室共享。作为早期的采纳者之一，施米特集团应用RT来监测硫芥菜抗性角化细胞的GSH水平变化。尽管我们的谷胱甘肽的成功探测,每种方法都有自己的优点和缺点。我们感谢Cossetti et al。为了验证RT探针和同意他们的主要结论RT可以用作谷胱甘肽探针只有当谷胱甘肽的量至少一个数量级比半胱氨酸(半胱氨酸)。利用这一机会，我们将强调RT调查的局限性，并澄清在Cossetti等人的通信中似乎存在的差异。
RT的传感机制是基于迈克尔受体与硫醇的可逆反应。从技术上讲，细胞中的所有硫醇，包括GSH、Cys和蛋白质硫醇，都会与rt发生反应。与许多GSH探针不同的是，我们对这一领域的主要贡献是将Michael acceptors和thiols之间的离解平衡常数(Kd)调到mM range6。与mM Kd的感应反应设计的好处有两个:i)允许在1-10毫米范围内对硫醇进行定量;和ii)对硫醇µM范围内基于比率计读数。
Cossetti等人发现,RT能够反应与谷胱甘肽和半胱氨酸在200µM浓度。这与我们在ref. 2中报告的图2c中所报告的数据是一致的。在图2c中，我们证明了GSH和Cys对RT有相似的反应，图2c中cyan的痕迹表明GSH或Cys的子mm浓度与少量RT发生反应，这是在Cossetti等人的HPLC实验中检测到的。然而，由于RT - thiols之间的mM Kd，硫醇的子mM浓度导致比值值的最小变化(图2c的蓝色痕迹)。不幸的是，Cossetti等人的HPLC实验(图1a, b在他们的通信中)只检测到RT-thiol adducts，并没有报告绝大多数未反应的RT。
我们认为HPLC法是定量测定不同硫醇的含量的金标准。Cossetti等人提到:“我们没有显示在H2O2处理前后，我们的HeLa细胞中是否存在Cys。”事实上,我们应用液相色谱质谱(LCMS)检查谷胱甘肽和半胱氨酸水平,发现谷胱甘肽是占主导地位的硫醇物种在我们的实验条件下(图1)。在Cossetti et al。图1 d,看来谷胱甘肽和半胱氨酸的水平可比(µM范围)在海拉细胞治疗200µM过氧化氢。然而，Cossetti等人的实验时间为24小时，比我们10分钟的治疗时间要长得多。在我们自己的手中,大部分的海拉细胞成为死200µM过氧化氢治疗24小时。
在Cossetti等人的图1c中，小鼠海马区Cys和GSH的水平几乎相同，分别为110和125。我们没有数据来比较这个测量。海马体是一个高度复杂的器官，至少有47个子类。基于HPLC的体积测量不能反映单个细胞的GSH和Cys水平，而且可能会由于含有高水平Cys8的间隙流体而变得复杂。与Cossetti等人的结果相比，Wang和Cynader报告说GSH水平至少是星形胶质细胞和神经细胞的10倍。尽管如此,半胱氨酸和条件下细胞内谷胱甘肽水平~ 100µM,RT不应使用浓度的动态范围。
Cossetti等人还指出，我们使用的1毫米NMM“不足以确保所有的硫醇都被阻挡，尤其是在GSH水平高于1毫米的细胞中”。应该注意的是,在实验部分100µM NMM ref。2是一个错误,应该纠正1毫米。我们没有选择10毫米的NMM来进行硫醇淬火，因为如果将10毫米的NMM添加到培养基中，细胞几乎会立即死亡，这使得后续的检测变得困难。NMM具有有限的水溶性。过量的NMM析出溶液，导致表观浓度低。考虑到培养基的体积比每个培养皿中所有细胞的量级都大，1毫米的NMM就足以抑制所有细胞内的硫醇。即使1mm的NMM没有完全与所有的硫醇反应，GSH-NMM和Cys-NMM adducts的比值也会保持不变，因为GSH和Cys对Michael受体的反应几乎相同。在我们的LC-MS实验中，我们只检测到GSH- nmm，而不是Cys- nmm，这表明GSH水平至少比Cys在实验条件下的高数量级(图1)。
Cossetti等人提到了硫醇和马来酰亚胺反应的可逆性，以证明高浓度的马来酰亚胺是合理的。基于Baldwin和Kiick的研究，对alkyl thiol和maleimide的回溯- michael添加的半衰期为300 h10，这表明如果在细胞裂解后不久对样品进行测量，就没有严重的问题。
尽管RT的优点，但是了解它的局限性以获得有意义的度量是很重要的。RT的传感部分本质上与所有小分子的硫醇反应，包括GSH、Cys、甚至是减少的锥虫，但对蛋白质硫醇的作用较小，可能是由于空间阻滞或电荷相互作用引起的。只有当GSH是小分子thiols和mM范围的主要形式时，RT才能被称为GSH探针。如果总浓度的小分子硫醇µM范围,RT不能进行准确的测量,因为它是在动态范围之外。如果Cys在细胞内的mM范围内，RT也会对Cys作出反应，尽管我们不知道哺乳动物细胞中的这种情况。因此，我们建议用户在使用HPLC方法或在使用RT探针之前，使用HPLC方法或搜索可用的文献数据，测量Cys和GSH的相对浓度。我们希望这次富有成效的讨论能够澄清混乱，并指导未来的应用。
