冠状病毒（CoV）是一组多样化的包膜病毒，可进一步细分为四个属：α-CoV、β-CoV、γ-CoV和δ-CoV。迄今为止，已知有7种CoV可导致人类疾病。其中，两种α-CoV（hCoV-NL63和hCoV-229E）和两种β-CoV（HCoV-OC43和HKU1）仅引起自限性的感冒类疾病。然而，其余三种β-CoV（SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2）则会危及生命。到目前为止，还没有临床上有效的预防或治疗人类高致病性CoV感染的药物，这凸显了疫苗开发的迫切性。
在CoV中，嵌入包膜中的刺突蛋白（S）负责识别宿主细胞受体，以启动病毒进入细胞。S蛋白的受体结合结构域（RBD）是这种受体停靠的必要条件。SARS-CoV和SARS-CoV-2使用相同的功能性宿主细胞受体---人血管紧张素转化酶2（hACE2），而MERS-CoV使用人CD26（也称为人二肽肽酶4，hDPP4）。科学家们之前已揭示了这些CoV识别宿主细胞受体的结构基础。
到目前为止，大多数强效中和单克隆抗体都靶向CoV RBD。因此，RBD是一个有吸引力的疫苗靶点，这是因为它可以将免疫反应集中在受体结合的干扰上。迄今为止，已有报道称，一些基于RBD的疫苗正在研制中，用于对抗MERS-CoV和SARS-CoV。然而，基于RBD的亚单位疫苗可能面临一些重要的挑战，主要来自于它们相对较低的免疫原性，因此它们必须与适当的佐剂组合使用，或者在合适的蛋白序列、片段长度和免疫方案方面对它们进行优化。增强基于RBD的疫苗免疫原性的策略包括增加抗原大小、多聚化或在颗粒中密集显示抗原，然而，这些策略不可避免地引入了外源序列，从而使得它们的临床使用潜力复杂化。
在一项新的研究中，来自中国科学院北京生命科学研究院、中国医学科学院医学实验动物研究所、中国科学院微生物研究所和中国疾病预防控制中心等研究机构的研究人员描述了一种通用的β-CoV免疫原设计，它克服了基于RBD疫苗的免疫原性限制。人们之前已经观察到CoV RBD二聚体，但它们的免疫原性尚未得到测试。他们发现，与传统的RBD单体形式相比，通过二硫键连接的RBD二聚体形式显著增强了抗体反应和中和抗体滴度。在小鼠模型中，它使得这些动物免受MERS-CoV感染，并缓解了肺部损伤。晶体结构显示这种RBD二聚体完全暴露了双受体结合基序（receptor binding motif, RBM），这是中和抗体识别的主要位点。
图片来自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.06.035。
相关研究结果于2020年6月28日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“A universal design of betacoronavirus vaccines against COVID-19, MERS and SARS”。论文通讯作者为中国科学院北京生命科学研究院的戴连攀（Lianpan Dai）、中国医学科学院医学实验动物研究所所长秦川（Chuan Qin）教授、中国科学院微生物研究所研究员严景华（Jinghua Yan）以及中国疾病预防控制中心主任、中国科学院微生物研究所的高福（George F. Gao）院士。
为了提高这种二聚体的稳定性，在不引入任何外源序列的情况下，通过结构引导设计，将这种免疫原进一步设计为串联重复单链二聚体（tandem repeat single chain dimer，串联重复sc-dimer）版本。RBD-sc-二聚体作为二硫键连接的二聚体保留了较高的疫苗效力。接着，这一策略被进一步推广到开发针对另外两种高致病性β-CoV---SARS-CoV-2和SARS-CoV---的疫苗。值得注意的是，与常规的RBD单体相比，RBD-sc-二聚体设计显著提高了免疫原性，中和抗体滴度提高了10～100倍，这表明它作为β-CoV疫苗设计通用策略的可行性。
特别是，两剂量的RBD-sc-二聚体引发的针对SARS-CoV-2感染的中和抗体滴度高达大约4096。对MERS-CoV和SARS-CoV-2的RBD-sc-二聚体进行了进一步开发，以便在GMP级生产中进行中试规模生产。这两者都可以在工业标准的CHO细胞系统中以高产量（g/L水平）进行生产，这表明这种策略具有可扩展性和进一步临床开发的前景，以便控制MERS-CoV和正在进行的COVID-19大流行。
一般而言，目前的候选CoV疫苗可分为两类：（i）基于基因的疫苗，包括DNA/mRNA疫苗、重组疫苗载体和活病毒疫苗，它们在宿主细胞中产生抗原；(ii) 基于蛋白的疫苗，包括灭活全病毒和蛋白亚单位疫苗，它们的抗原在体外制造。蛋白亚单位疫苗在传统上用于疫苗开发，这类疫苗在预防乙型肝炎和带状疱疹等疾病方面具有良好的安全性和有效性。在这项新的研究中，这些研究人员报道了CoV RBD-sc-二聚体作为蛋白亚单位疫苗的设计，代表了CoV疫苗开发的一条有前途的途径。
结构指导下的抗原设计是快速、精确制造疫苗的重要工具。全长S蛋白是作为CoV抗原亚单位疫苗的另一种常见的选择。全长三聚体S蛋白通常具有很高的免疫原性，原因很可能是它具有较大的尺寸（大约600kDa）。它不仅包含RBD，即强效中和抗体的主要靶点，还包含也能诱导中和抗体或保护性抗体的非RBD区域，比如N端结构域。人们之前已报道了一种通过基于结构的抗原设计来让MERS-CoV S蛋白融合前构象保持稳定从而提高基于全长S蛋白的CoV疫苗疗效的通用策略。然而，由于已报道针对CoV免疫反应的抗体依赖性增强（ADE）现象，人们寻求最小化的有效免疫原。另外，CoV S蛋白的RBD已被认为是一个有吸引力的疫苗靶点，这是因为它在免疫聚焦（immune focusing）方面具有优势，但可能需要有效的佐剂和多剂量来产生足够的免疫原性。
这些研究人员将这种二硫键连接的RBD二聚体鉴定为免疫原：与常规的RBD单体相比，它的免疫原性显著提高，这一点通过中和抗体滴度来证实。通过结构引导设计，这种RBD二聚体经过进一步改造后成为串联重复sc-二聚体，这可以成为β-CoV疫苗设计的一种通用策略。事实上，利用RBD-sc-二聚体对小鼠进行两次免疫足以使所有针对MERS、COVID-19和SARS的测试疫苗获得高水平的抗体反应。据此，将采用两剂疫苗接种方案来评估基于RBD-sc-二聚体的CoV疫苗在动物模型和人体中的保护效果。值得注意的是，在三次免疫后， RBD单体的免疫原性与两次接种sc-二聚体疫苗相似。特别是对于SARS-CoV疫苗，RBD-sc-二聚体在三次免疫后仅表现出略高的抗体反应（** P<0.01）和中和抗体滴度（* P<0.05）。
RBD-sc-二聚体免疫原性增强的原因是：(i)抗原分子量从约30kDa翻倍到约60kDa；(ii)双RBM，即这种二聚体双价地发挥作用，这可能使B细胞中的B细胞受体交联，以获得更好的刺激；(iii)RBD的二聚体界面上的非RBM表位可能被阻塞，以进一步提高免疫聚焦；(iv) 优势免疫表位的暴露。
总之，这些研究人员提供了一种通用的策略来设计β-CoV疫苗，并在针对MERS、COVID-19和SARS的疫苗开发中证实了这个概念。由此产生的免疫原可应用于其他表达系统，如酵母、昆虫细胞，也可应用于其他疫苗平台，如DNA、信使RNA和疫苗载体。经过改造的RBD-sc-二聚体不引入任何外源序列，从而突显了这种基于RBD-sc-二聚体的CoV疫苗临床开发的可行性。这项研究中描述的COVID-19和MERS候选疫苗有希望从实验台进一步进展到临床。g/L水平的抗原产量突出了扩大生产能力，以便满足全球的迫切需求，特别是针对大流行性COVID-19的需求。
这项研究存在的局限性
众所周知，CoV RBD是中和抗体干扰病毒受体结合的主要靶点，这些研究人员关注的是基于RBD的疫苗所诱导的体液反应。还应进行扩展研究，比如被动转移实验，以进一步证实这种体液反应是否足以抵御CoV的挑战，尽管他们近期的研究工作通过使用人源单克隆抗体证实了被动保护的存在。另外，虽然在重组蛋白型疫苗的研究中，磷酸盐缓冲液（PBS）和PBS加佐剂都被广泛用作安慰剂，但使用给予无关蛋白加佐剂的对照组将是一种更好的阴性对照选择。（生物谷 Bioon.com）
