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《APSB |上海药物所开发出糖链定点偶联新策略实现定点ADC化合物的“一步”制备》

  • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
  • 编译者： hujm
  • 发布时间：2022-02-21

  • 　抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates,ADCs）通过化学连接将细胞毒素连接至抗体，利用抗体的靶向作用实现毒素对肿瘤的特异性杀伤。通过定点偶联技术得到的ADC化合物相比随机偶联具有更好的治疗指数，是目前ADC领域的研究热点之一。
    　　Fc结构域N297位是抗体保守的糖基化位点，在该位点引入细胞毒素形成的糖链定点ADC化合物（glycosite-specific ADCs, gsADCs）具有不影响抗原结合、稳定性更好等优势，近年来受到广泛关注。目前，已报导的糖链定点偶联策略首先需要对抗体进行糖工程改造，通过糖基转移酶或糖苷内切酶在糖基化位点引入生物正交基团，进一步通过生物正交反应偶联毒素，从而实现糖链定点ADC的制备（如图1所示）。整个过程往往需要2-3种酶的参与，3-4步的反应，底物合成复杂且依赖于生物正交反应，阻碍了糖链定点ADC药物系统性的构效关系研究。
    　　为解决上述关键问题，中国科学院上海药物所黄蔚课题组开发了新颖的糖链定点ADC制备策略。基于新颖截短型糖结构的药物-连接子和野生型糖苷内切酶Endo-S2，将小分子细胞毒药物“一步”定点连接到抗体糖基化位点，实现糖链定点ADC化合物的制备。该研究成果于2021年12月24日以“One-step synthesis of site-specific antibody-drug conjugates by reprogramming IgG glycoengineering with LacNAc-based substrates”为题发表在《药学学报》英文刊（Acta Pharmaceutica Sinica B）上。
    　　研究人员首先筛选了一系列糖底物和糖苷内切酶，发现野生型糖苷内切酶Endo-S2可以将二糖底物LacNAc转移至去糖抗体N297位糖基化位点，且LacNAc半乳糖6号位唾液酸化修饰不影响Endo-S2的转糖基化活性（如图2A所示）。由于Endo-S2本身是非常强的特异性水解抗体N297位点不均一N-糖链的水解酶，而研究发现其可以催化LacNAc转移至糖基化位点，同时丧失对LacNAc修饰抗体的糖链水解活性。这表明Endo-S2和LacNAc的组合可以直接实现野生型抗体的糖基化改造，且Endo-S2对多样化LacNAc修饰的兼容性，可以高效获得多样性功能修饰的岩藻糖化或去岩藻糖化的糖工程抗体（如图2B所示），以及实现抗体的内吞成像研究及糖链延伸等功能化研究。
    　　研究人员进一步利用叠氮化修饰的LacNAc底物实现了抗体糖基化位点的“一步”叠氮化修饰，并通过点击化学反应偶联药物-连接子BCN-Lys(PEG)24-VC-PAB-MMAE，“两步”制备得到定点ADC化合物gsADC-1。此外，研究人员直接在LacNAc半乳糖6号位偶联毒素MMAE，获得LacNAc-VC-PAB-MMAE复合物，并在Endo-S2的催化下直接实现了MMAE连接至抗体糖基化位点，“一步”获得了均一性的糖链定点ADC化合物gsADC-2。高分辨质谱分析、疏水相互作用分析（HIC）、聚集稳定性分析（SEC）测试显示，上述两种策略获得的糖链定点ADC化合物具有非常好的结构均一性（drug to antibody ratio，DAR=2）、亲水性和体外稳定性，获得的ADC化合物具有很强的体外肿瘤抑制活性。同时，在NCI-N87肿瘤模型中，相比阳性对照ADC化合物（DAR=3.5）及前期寡糖链定点ADC化合物（DAR=4），该策略研发的糖链定点ADC化合物（DAR=2）在低载药量的情况下依然具有更强的体内肿瘤抑制活性。上述研究体现了基于截短型连接子LacNAc形成的糖链定点ADC化合物不仅具有更好的工艺优势，也具有显著的药效优势。除研究使用的曲妥珠单抗外，策略同样适用于其它治疗性单抗、双特异性抗体及Fc融合蛋白。
    　　综上所述，研究人员基于截短型糖连接子LacNAc和糖苷内切酶Endo-S2，实现了野生型抗体的“一步”糖基化改造，并建立了糖链定点ADC化合物的“一步”制备策略。该策略克服了传统“两酶三步”糖链定点ADC制备策略的限制，实现了小分子细胞毒药物的“一步”定点组装，避免了对生物正交反应的依赖，同时该策略的工艺优势将促进糖链定点ADC药物系统的构效关系研究，有利于推动定点ADC药物的深入发展。
    　　上海药物所博士后施伟为本文的第一作者，上海药物所黄蔚研究员、唐峰副研究员为本文共同通讯作者。同时，该工作还获得上海药物所宫丽崑研究员、李铁海研究员及聊城大学范树泉老师的帮助。该研究得到了国家自然基金委、上海市科技重大专项、中国科学院特别研究助理计划、山东省自然科学基金等项目的资助。
    全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383521004858

  • 原文来源：http://www.simm.cas.cn/web/xwzx/kydt/202201/t20220113_6339903.html
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相关报告

  • 《ANGEW | 上海药物所在定点药物偶联物制备技术方面取得新进展》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2022-07-03
    • 　抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是将小分子细胞毒性药物共价偶联物到抗体上形成的复合物，利用抗体特异性达到小分子药物靶向递送，实现肿瘤的选择性杀伤。近年来研究发现，将小分子药物定量偶联到抗体的特定位点所形成定点ADC药物具有更好的治疗指数，逐渐成为ADC药物领域研发的重点。但由于抗体复杂的氨基酸组成，通过化学手段定点偶联小分子药物一直充满挑战。其中，配体导向的定点偶联技术是一种潜在的方法，但冗余的配体难以释放或复杂的释放过程限制了该技术在定点ADC药物研发中的应用。 　　为了解决上述问题，中国科学院上海药物所黄蔚课题组开发了基于硫酯结构的新颖配体导向酰化试剂，在定点修饰抗体特定位点赖氨酸的同时自动释放冗余的配体结构，首次通过化学手段实现定点抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）的“一步”、“无痕”制备策略，为定点ADC药物发展提供了新颖的制备方法。相关研究成果以 “A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload Assembly” 为题在线发表于学术期刊Angewandte Chemie International Edition上。 　　研究团队利用该技术实现了天然抗体曲妥珠单抗的“一步”定点叠氮化、生物素化以及多种小分子药物等不同形式的功能性分子修饰，均特异性地偶联2分子化合物。高分辨质谱、质谱组学分析等分析手段均证明小分子修饰特异性地发生在抗体Fc区域的K248位（通用命名位点），具有极高的位点选择性。同时，该技术也同样适用于利妥昔单抗、帕妥珠单抗、贝伐单抗等IgG1抗体，帕尼单抗等IgG2抗体、纳武利尤单抗等IgG4抗体，具有很好的底物普适性。 　　随后，团队基于曲妥珠单抗制备了4种具有不同药物连接子的“一步法”定点ADC化合物，以及3种基于生物正交反应的“两步法”定点ADC化合物，并对其进行了初步的药学评价。所有的ADC化合物均具有很好的结构均一性（DAR=2）、很强的体外肿瘤细胞抑制活性（＜0.1 nM）及极低的细胞毒性（≥1000 nM）。同时，相比随机偶联制备的阳性ADC化合物（DAR≈3.3），利用该技术获得的多个定点ADC化合物虽然具有更低的载药量（DAR=2），但显示出更强的体内肿瘤抑制活性。 　　综上所述，该研究团队通过设计新颖的酰化试剂及对配体结构的优化，实现了天然抗体特定位点赖氨酸的“一步”、“无痕”定点定量修饰。该技术首次通过化学手段实现了定点ADC化合物的高效、均一制备，无需进行抗体的工程化改造，不依赖生物正交反应，且兼容多样化的底物结构和抗体类型，为定点ADC药物研发提供了重要的技术方法。 　　上海药物所黄蔚研究员与唐峰副研究员为论文通讯作者，上海药物所博士研究生曾悦为论文第一作者。该论文还得到了来自上海药物所周虎研究员、黄河研究员、刁星星研究员在小分子修饰位点鉴定方面的大力支持和帮助。该工作得到国家自然科学基金、中国科学院特别研究助理项目、上海市扬帆计划、上海市科技重大项目、杭州创新创业领导团队项目及临港实验室的基金支持。 　　全文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202204132
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  • 《Angew. Chem.：上海药物所发现点击化学操控新策略》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2020-07-29
    • 2020年7月22日，中国科学院上海药物研究所黄蔚课题组和杨伟波课题组在Angew. Chem. Int. Ed.上发表了题为“Manipulating the click reactivity of dibenzoazacyclooctynes: from an azide cliker to a caged acylation reagent.”的文章，报道了点击化学试剂二苯并氮杂环辛炔（DBCO）的银催化重排和转酰胺反应，通过其“笼缚”酰化反应性，实现蛋白/糖蛋白修饰和抗体定点偶联。 　　叠氮-炔环加成反应的点击化学，被广泛应用于有机化学、药物化学、化学生物学、分子生物学、细胞生物学等多学科领域。铜催化叠氮-炔点击化学反应是一类高效的生物正交反应，但铜催化体系在生物体系中具有较差的生物相容性。环张力炔基如DBCO、BCN等可以在无铜催化的温和条件下实现叠氮-炔基的环加成，极大地促进了点击化学在活生物体系中的应用。 　　上海药物所黄蔚研究员和杨伟波研究员合作，发现环张力炔基DBCO结构可以在酸性条件下重排丧失其点击化学反应活性。通过研究进一步发现，银试剂AgNTf2或AgOAc可以在中性条件下促进DBCO快速重排生成四环产物，并且当反应体系有胺类化合物时，会发生转酰胺反应，形成新的酰胺产物。在此过程中，银试剂催化转酰胺反应具有“笼缚”酰化试剂属性：无催化剂条件下其酰化活性“束缚”在DBCO“笼状”结构中，而在银催化下从“笼”中释放其酰化能力。在与叠氮基团的竞争反应中，银试剂催化转酰胺反应效率远高于叠氮点击化学反应，酰化产物产率高达95%。 　　研究团队选择了不同的含有氨基的小分子化合物、多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白等，对该反应进行了底物反应活性和选择性的探索（图2）。研究发现，银催化条件下，DBCO可以快速的酰化氨基官能团；针对三种包含20种天然氨基酸的多肽底物的研究发现，DBCO酰化反应高选择性地发生在Lys的氨基上，而不影响其他氨基酸。同时，银催化DBCO酰化反应可以高效地修饰糖肽、BSA蛋白、糖蛋白RNase B 和IgG抗体等，表现出较好的底物适用性。此外，银催化酰化反应可以实现Ph.D.12商业噬菌体库的修饰且不影响噬菌体侵染活力，说明该方法具有应用于活生物体系中的潜力。 　　该研究团队还设计了一种DBCO标记的抗体Fc靶向肽，实现了抗体上特定Lys的定点酰化修饰（图3）。利用靶向肽与抗体Fc的亲和力，将其DBCO标记基团运输到K249附近，在此过程中，DBCO的酰化活性处于“笼缚”状态而不会与抗体发生随机偶联。而在银催化下，DBCO重排，相应酰基选择性地修饰Fc区域的K249，高效实现了抗体的定点偶联，为定点抗体药物偶联物的设计提供了新的方法与思路。 　　综上所述，银催化下DBCO重排酰化反应，改变了DBCO的点击化学反应性，从一个叠氮点击反应试剂，转变为高效、温和、可控的“笼缚”酰化试剂，且具有很好的生物兼容性，可以应用于多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白、噬菌体等多种生物活性底物。此外，DBCO标记的Fc结合肽可以选择性地酰化抗体上的特定Lys，实现抗体的定点偶联。该方法在化学生物学领域具有广泛的应用前景，可以用于配体导向的靶蛋白定点修饰、配体-受体共价捕获、相互作用蛋白-蛋白交联等。 　　黄蔚课题组一直从事蛋白糖基化调控与修饰（Nat. Protoco. 2017, 1702; Org. Biomol. Chem. 2016, 9501; J. Am. Chem. Soc. 2012, 12308）、细胞表面糖链编辑(Nat. Chem. Biol. 2020, doi.org/10.1038/s41589-020-0551-8)、糖结构药物(Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 6678; J. Med. Chem. 2018, 286)等方向研究；杨伟波课题组聚焦天然产物启发的大环库构建新方法学研究，包括过渡金属催化碳氢活化、卡宾偶联以及重排等。黄蔚课题组博士生施伟和博士后唐峰为文章共同第一作者，黄蔚研究员和杨伟波研究员为共同通讯作者。药物所黄河课题组团队在抗体定点偶联的位点鉴定中给予了技术支持，黄蔚课题组毕业研究生敖继炜和郁群在项目早期酸催化DBCO重排工作中作出了重要贡献，为文章合作作者。该项目获得了国家自然科学基金、国家“重大新药创制”专项等项目资助。
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