《中科院学者Nature Protocols:空间转录组测序新技术》

  • 来源专题:转基因生物新品种培育
  • 编译者: Zhao
  • 发布时间:2017-02-28
  • 近期来自中科院生物化学与细胞生物学研究所细胞生物学国家重点实验室等处的研究人员作建立了一种可以获得具有空间位置信息的少量细胞转录组图谱的技术方法:Geo-seq,这种方法不仅能解析少量细胞转录组信息,而且还能保留细胞原有位置信息。这一研究成果公布在2月16日的Nature Protocols杂志上,Nature Protocols杂志虽然影响因子不算高,但是作为描述详细的实验步骤及注意事项的技术手册,近年来越来越受到广泛的关注。文章的通讯作者分别为细胞生物学国家重点实验室景乃禾研究员与彭广敦副研究员,第一作者为陈军博士。去年景乃禾研究员与中科院-马普学会计算生物学伙伴研究所韩敬东研究组合作,结合了激光显微切割以及单细胞测序等先进技术,绘制了小鼠早期发育原肠运动中期精细的胚胎三维分子图谱,并揭示了小鼠细胞谱系蓝图建立过程中的空间转录组特征、转录因子和信号通路调控网络。

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    • 来源专题:转基因生物新品种培育
    • 编译者:王晶静
    • 发布时间:2021-06-07
    • 2021年3月12日,中国科学院北京生命科学研究院研究员赵方庆团队在Nature Biotechnology上发表了题为Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long的论文,研究内容为高效测定环形RNA全长转录本的实验和计算方法。该研究主要是利用随机引物对环形RNA进行的滚环反转录扩增,而后应用纳米孔测序技术对环形RNA的全长序列进行直接测序,并使用开发的CIRI-long算法识别长测序读段中的环形RNA序列并进行全长重构。实验结果表明,与传统的环形RNA二代测序技术相比,该方法将环形RNA检测灵敏度提升了20倍,并可实现对不同长度(<100bp-5kb)的环形RNA全长序列的无偏识别,大幅提升了环形转录本的重构能力,为其功能研究提供了重要的实验方法和计算工具。 环形RNA是一类在真核生物中广泛存在的具有特殊环状结构的RNA分子。研究表明,在生物体内,环形RNA主要通过其序列特征,发挥miRNA海绵、RBP海绵及翻译短肽等重要的生物学功能。因而环形RNA的全长序列确定是进行环形RNA功能研究的重要基础。由于环形RNA的内部序列与线性mRNA分子高度相似,在数据中很难区分来自环形RNA和线性RNA分子的读段。研究方法对于环形RNA结构的识别能力主要被二代测序的读长所限制,对于长度较长(>500bp)的环形RNA分子,仍缺少有效的全长重构手段。 针对这一问题,研究团队构建并优化环形RNA建库流程,使用随机引物对环形RNA进行滚环反转录扩增,结合片段长度筛选(~1kb),针对长度更长的目标cDNA片段进行富集,最后使用纳米孔测序技术,实现了对目标环形RNA的全长序列进行直接测定。同时,研究人员进一步开发了CIRI-long算法,识别纳米孔测序数据中的环形RNA结构,并使用偏序比对算法,校正纳米孔测序带来的测序错误。随后,CIRI-long基于基因注释和剪接信号信息,提供单一样本内和多样本间结果的整合与校正方法,实现了环形RNA的准确识别和全长重构。为了评估CIRI-long方法的准确性和效率,研究人员利用模拟数据和多次实验重复,综合评估CIRI-long结果,发现该方法具有较高的灵敏度,且与实验结果保持了高度的一致性。同时,结合二代测序结果及公共数据库的全面分析,表明CIRI-long可有效地对高表达环形RNA进行识别,且与二代测序方法相比,CIRI-long对环形RNA的检测效率有着近20倍的提升,对表达丰度较低的环形RNA有着更好的识别效果,同时可以识别到长度更长的环形RNA分子,大幅提升了环形RNA全长的检测能力。利用该方法,研究进一步发现了一类由内含子自连形成的新型环形RNA分子(Intronic self-ligated circRNA)。这类环形RNA具有特殊的剪接位点内侧的GT-AG信号和较高的两侧序列保守性,在之前工作中缺乏普遍研究。此外,研究人员在小鼠不同组织中,对内含子自连型环形RNA的表达模式开展了进一步探究,发现Tpm1基因可以产生一个长度为767bp的内含子自连型环形RNA——circTpm1。与Tpm1基因的其他内含子相比,该分子成环区域具有相对较高的保守性,且与线性mRNA在组织间具有不同的表达模式,说明circTpm1并非其母本基因转录的副产物,可能具有一定的生物学功能。综上,研究人员开发了基于纳米孔测序技术的环形RNA全长识别流程CIRI-long,通过结合滚环反转录扩增和纳米孔长读长测序技术,可直接测定环形RNA的全长序列,实现了对环形RNA的高灵敏度检测和内部结构重构。与传统的二代测序方法相比,CIRI-long大幅提升了环形RNA全长重构能力,并可实现与二代测序相近的分析成本。同时,CIRI-long提供了样本间整合分析的工具,并针对纳米孔测序的高错误率建立了有效校正方法,为环形RNA的功能研究提供了重要的方法学工具,具有很高的应用价值。 该研究工作由赵方庆团队完成,获得国家杰出青年科学基金、国家重点研发计划及中科院的支持。赵方庆团队在前期的工作中建立了环形RNA识别、可变剪接检测及定量等方法,相关研究发表在Nature Biotechnology(2021)、Nature Communications(2016,2020)、Genome Biology(2015,2020)、Briefings in Bioinformatics(2018)、Trends in Genetics(2018)、Genome Medicine(2019)、Cell Reports(2019)和Bioinformatics(2020)上。这些研究成果丰富了我们对环形RNA的组成及结构的认识,为深入了解这一类特殊的RNA分子提供了重要工具和数据支持。 论文链接:https://www.nature.com/articles/s41587-021-00842-6
  • 《中科院高彩霞研究组最新发文:利用基因组编辑精细调控草莓糖分含量》

    • 来源专题:转基因生物新品种培育
    • 编译者:zhangyi8606
    • 发布时间:2020-10-11
    • 无性繁殖植物在农业生产中具有重要的地位,但是长期无性繁殖导致性状多样性的严重匮乏极大的阻碍了无性繁殖作物的育种发展。在育种设计中,对数量性状的精细调控可以避免产生剧烈的性状变化,并且可以极大的丰富性状多样性,对推进精准育种有重要意义。 基因组编辑技术通过对调控元件的遗传操作可以实现对数量性状的改良。对于无性繁殖的植物,纯合和杂合基因型都可以通过无性繁殖稳定遗传,可以获得更多可稳定遗传的基因型,进一步丰富性状多样性,对数量性状实现更加精细的调控。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组发现对基因上游转录起始位点(uORF)进行编辑可以显著提高基因翻译效率,建立了基因组编辑调控植物内源基因翻译效率技术体系(Nature Biotechnology,2018; Nature Protocols,2020)。利用这一技术,最近高彩霞研究组在无性繁殖作物草莓中实现了对数量性状的精细调控并获得了多种不同糖分含量的草莓。 研究人员首先建立了高效的草莓胞嘧啶单碱基编辑技术体系,利用本实验室开发的植物高效胞嘧啶碱基编辑器(A3A-PBE,Nature Biotechnology,2018)首次在草莓中实现碱基编辑,转基因草莓植物中碱基编辑效率高达100%。 A3A-PBE具有效率高和编辑窗口宽的特点,在草莓中,其编辑窗口宽度达到15bp。研究人员利用A3A-PBE对草莓FvebZIPs1.1基因的保守的uORF进行编辑,在T0代获得7种不同的新uORF突变。七种新uORF突变的纯合突变体中果实糖含量出现了不同程度的提高,而且植物生长未受影响。 为了进一步丰富基因型和性状多样性,研究人员对T0代突变体进行了自交和杂交,组合不同的等位基因并分离转基因成分。T1代共计获得了35种不同基因型的草莓,而且这些草莓均无外源基因。不同基因型对草莓果实糖含量产生了不同程度的影响,极大的丰富了性状多样性,实现了对数量性状的精细调控。尤为重要的是,所有的新基因型和性状都可以通过无性繁殖稳定传递给后代。 该工作为无性繁殖作物提供了新的育种策略。这一研究成果于2020年9月3日在Genome Biology杂志发表(DOI:10.1186/s13059-020-02146-5)。高彩霞研究组博士后邢思年和副研究员陈坤玲为该论文的共同第一作者,高彩霞研究员为该论文通讯作者。 原文标题: Fine-tuning sugar content in strawberry