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《研究解析新冠病毒聚合酶催化复合物结构和瑞德西韦作用机制》

  • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者： hujm
  • 发布时间：2020-07-28

  • 与脊髓灰质炎、SARS/MERS、流感、埃博拉、寨卡等其他RNA病毒类似，新冠病毒的转录复制过程由自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，简称RdRP）来主导完成。有些RdRP如脊髓灰质炎病毒的3Dpol蛋白可相对独立地实现RNA合成，而冠状病毒的RdRP蛋白nsp12在发挥转录复制功能时还需要nsp7和nsp8这两个辅助因子参与，工作机制较为复杂。当前备受关注的核苷类抗新冠药物瑞德西韦（remdesivir）、法匹拉韦（favipiravir）均以其三磷酸核苷效应分子的形式直接靶向nsp12，但相关作用机制尚不明晰。因此，从结构生物学和酶学水平探索新冠病毒RdRP-nsp7-nsp8转录复制机器的工作机制和核苷类药物的作用机制，对了解新冠病毒的本质特征和研发有效药物具有重要意义。

    2020年5月22日，上海科技大学和中国科学院武汉病毒研究所合作，结合双方在结构病毒学和RdRP研究中的长期积累，在Cell杂志上发表题为“Structural basis for RNA replication by the SARS-CoV-2 polymerase”（《新冠病毒聚合酶实现RNA复制的结构基础》）的文章，报道了新冠病毒聚合酶在催化RNA合成过程中的“转位前”和“转位后”两种重要状态的构象特征（图1及图2）。合作团队通过筛选十余种RNA成功获得了经历四轮催化反应的“转位后”复合物结构（PDB号7BZF，分辨率3.26埃，图2A），进而通过改变复合物下游模板序列以允许瑞德西韦效应分子参与催化而获得了一种“转位前”复合物结构，其中瑞德西韦成功 “混入”了产物RNA链中，并且完成了向上游的转位（PDB号7C2K，分辨率2.93埃，图2B）。研究团队通过生化活性数据与结构结果相支撑，首次验证了瑞德西韦在“混入”产物链后与双链RNA退出通道中的关键氨基酸S861产生位阻效应，从而导致产物链在瑞德西韦首次“混入”后需再经历三轮催化方发生链终止（也称“i+3延迟终止”）的机制（图3及图4）。本研究首次精细描绘出了新冠病毒“RdRP-nsp7-nsp8”转录复制机器处在工作状态下的核心特征，展现了复合体辅助部件参与反应的分子机制和结构基础，并为瑞德西韦和法匹拉韦等候选药物的效应分子如何精确靶向抑制病毒RNA合成进而发挥药效活性提出了机制解释。

    上海科技大学王权助理教授和武汉病毒所吴继芹助理研究员等五人为本文共同第一作者。清华大学教授、中国科学院生物物理所研究员，上科大兼职教授饶子和院士、中国科学院武汉病毒所龚鹏研究员、上科大王权助理教授为本文共同通讯作者。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金等项目的支持。

  • 原文来源：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30629-2;http://www.whiov.cas.cn/kxyj_160249/kyjz_160280/202006/t20200615_5605727.html;
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  • 《Cell：从结构上揭示新冠病毒复制/转录复合物中解旋酶-聚合酶偶联机制》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2020-08-03
    • 冠状病毒属于套式病毒（Nidovirales）目，是一类正链RNA（+RNA）病毒。这些病毒是几种人畜共患传染病的罪魁祸首。致命的事件包括2003年由SARS-CoV引起的严重急性呼吸道综合征（SARS）大流行和由MERS-CoV引起的中东呼吸道综合征（MERS）疫情。作为一种β冠状病毒，SARS-CoV-2已被确定为当前全球破坏性的2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行的原因。 套式病毒包含已知最大的RNA基因组。套式病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp，由非结构蛋白12编码，缩写为nsp12)在RdRp 全酶（holo-RdRp，包括nsp7/nsp82/nsp12）中发挥作用，合成所有病毒RNA分子。RdRp是瑞德西韦等抗病毒药物的靶点。除了在病毒基因组的复制和转录中发挥核心作用外，RdRp还包含一个N端套式病毒RdRp相关的核苷酸转移酶（nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase, NiRAN）结构域，这个结构域功能未知，但具有对病毒传播必不可少的酶活性。 holo-RdRp被认为在病毒生命周期中与一些辅助因子进行协调。这些辅助因子之一是nsp13，它是一种以NTP依赖的方式以5'->3'极性解开DNA或RNA的超家族1B（SF1B）螺旋酶。这种螺旋酶对于套式病毒马动脉炎病毒（equine arteritis virus, EAV）和β冠状病毒小鼠肝炎病毒的复制是必不可少的，并被推测在所有套式病毒中都是必不可少的。这种螺旋酶被认为在病毒生命周期的许多方面发挥着关键作用。除了具有螺旋酶活性，nsp13还具有可能在mRNA加帽中发挥作用的RNA 5'-三磷酸酶活性。 除了具有SF1螺旋酶的两个经典的RecA ATP酶结构域，nsp13还含有套式病毒螺旋酶特有的三个结构域：一个N端锌结合域（ZBD）、一个柄和一个1B结构域。在体内，这些结构域在nsp13功能中的作用尚不清楚，但是这些结构域中或它们之间的界面发生的替换突变对体外螺旋酶的活性以及病毒传播有破坏性影响。 生物化学和生物物理学研究提示着nsp13和nsp12相互作用，但是它们之间形成的一种稳定的复合物尚未通过生物化学手段分离出来，也未从结构上加以表征，而且这种螺旋酶在SARS-CoV-2复制-转录中的机制作用尚不清楚。 在一项新的研究中，来自美国洛克菲勒大学、纽约结构生物中心和瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员获得了稳定的nsp13:holo-RdRp:RNA复合物，并通过低温电镜（cryo-EM）解析出它的三维结构，标称分辨度为3.5埃。这种复合物的结构限制了nsp13的功能模型，并提出nsp13可能促进复制/转录复合物（replication/transcription complex, RTC）向后移动（称为回溯），因而可能影响它的校正和模板切换功能。利用解析出的三维结构，他们还确定了ADP-Mg2+在套式病毒特异性NiRAN结构域活性位点中的结合位置，这为抗病毒治疗开发提供了一个新的靶标。相关研究结果于2020年7月28日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Structural basis for helicase-polymerase coupling in the SARS-CoV-2 replication-transcription complex”。 在nsp13:holo-RdRp:RNA复合物的结构中，螺旋酶nsp13与RTC的主要相互作用决定因素发生在nsp13-ZBD和nsp8-N末端延伸片段之间。这两个结构元素都是套式病毒所特有的，并且它们的相互作用界面在α冠状病毒和β冠状病毒属内是保守的，这表明这种相互作用代表了SARS-CoV-2复制/转录的一个关键方面。在之前的研究中，对SARS-CoV-1 ORFeome进行的蛋白-蛋白相互作用分析已确定了nsp8是病毒蛋白-蛋白相互作用的中心枢纽。nsp8a和nsp8b的结构架构，以及它们的长N端螺旋延伸，为一系列复制/转录因子的结合提供了一个大的结合面。 这种复合物的结构揭示ADP-Mg2+占据NiRAN结构域的活性位点，这可能是因为RdRp样品在网格制备之前用ADP-AlF3孵育。ADP与nsp13没有发生碱基特异性相互作用；nsp12-NiRAN-H75与腺嘌呤碱基形成阳离子-π相互作用，但是这种相互作用预计不是强烈的碱基特异性，结构建模也没有为碱基特异性相互作用提供明显的备选方案。在NiRAN结构域An对齐中，对应于H75的位置并不是保守的，这表明；i）这个氨基酸残基不是NiRAN结构域活性位点的碱基特异性的决定因素，ii）NiRAN结构域的碱基特异性在不同的套式病毒之间存在差异，或者iii）在一般情况下，NiRAN结构域的活性不表现出碱基特异性。 这些作者注意到NiRAN结构域的酶活性对病毒传播至关重要，但是它的作用靶标是未知的。需要开展进一步的实验才能更全面地了解NiRAN结构域的活性、它的首选底物以及它的体内靶标，而这些可能在不同的套式病毒中有所不同。这些结果为研究这些问题的生化、生物物理和基因实验提供了结构基础，也为抗病毒药物开发平台提供了结构基础。
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  • 《我国科学家从结构上揭示瑞德西韦抑制新冠病毒RNA依赖性RNA聚合酶机制 》
    • 来源专题：中国科学院病毒学领域知识资源中心
    • 编译者：malili
    • 发布时间：2020-05-25
    • 2020年5月23日讯/生物谷BIOON/---由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19大流行已成为一场人道主义危机，截至2020年4月8日报告的感染人数超过150万，死亡人数超过8.7万，到2020年4月27日已迅速增加到感染人数超过299万和死亡人数20.7万。SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和β冠状病毒家族中的几个成员（包括蝙蝠冠状病毒和穿山甲冠状病毒）密切相关。可能是由于SARS-CoV-2病毒刺突蛋白与宿主受体的结合亲和力较强，SARS-CoV-2在人与人之间的传播率要高得多，从而导致全球范围内的感染。 SARS-CoV-2是一种正链RNA病毒。它的复制是由病毒非结构蛋白（nsp）的多亚基复制/转录复合物介导的。这种复合物的核心成分是RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的催化亚基（nsp12）。nsp12本身几乎没有什么活性，其功能需要包括nsp7和nsp8在内的辅助因子，这些辅助因子可以增加RdRp的模板结合和持续合成能力。RdRp也被提出是一类称为核苷酸类似物的抗病毒药物---包括瑞德西韦（remdesivir, 也称为GS-5734）---的靶点，其中瑞德西韦是一种前体药物，在细胞内可转化为三磷酸形式的活性药物。因此，RdRp一直是结构生物学研究的重点。科学家们已解析出nsp7、nsp8以及nsp12-nsp7-nsp8复合物的结构，并提供了RdRp复合物的整体结构。然而，由于没有SARS-CoV-2 RdRp与RNA模板或核苷酸抑制剂所形成的复合物的结构，药物发现工作受到阻碍。 在一项新的研究中，来自中国科学院、浙江大学、清华大学、北京协和医院、无锡佰翱得生物科学有限公司、上海交通大学和浙江省免疫与炎症疾病重点实验室的研究人员解析出SARS-CoV-2 RdRp复合物在apo形式（apo form）下以及与模板-引物RNA和抗病毒药物瑞德西韦（Remdesivir）结合在一起时的两种低温电镜结构。相关研究结果近期发表在Science期刊上，论文标题为“Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir”。 为了开展低温电镜研究，这些研究人员将nsp12与nsp7和nsp8在昆虫细胞中共表达，从而形成核心RdRp复合物（图1A）。nsp7和nsp8的化学计量比似乎小于nsp12，因此，在最后的纯化步骤之前，补充了额外的细菌表达的nsp7和nsp8，以提高异源三聚体复合物的产量。纯化的nsp12在与长50个碱基的部分双链模板-引物RNA的结合上表现出很小的活性（图1B），这与SARS-CoV的nsp12相类似。nsp7和nsp8的存在显著增加了nsp12与模板-引物RNA的结合。在加入三磷酸腺苷（ATP）后，nsp12-nsp7-nsp8复合物在聚尿嘧啶模板上也表现出RNA聚合活性（图1，B和C）。这种RNA聚合活性可被加入的瑞德西韦的活性三磷酸形式（triphosphate form of Remdesivir, RTP）有效抑制（图1D）。即使在10 mM ATP的存在下，1 mM RTP也完全抑制了RdRp的聚合活性。相比之下，作为一种前体药物，瑞德西韦在5 mM浓度下，对这种纯化的RdRp酶的聚合活性没有任何抑制作用，瑞德西韦的单磷酸形式（Remdesivir in its monophosphate form, RMP）也没有这种抑制能力。 图1.nsp12-nsp-7-nsp8 RdRp活性复合物的组装以及瑞德西韦对它的抑制作用。 纯化的RdRp复合物在53℃的解链温度下相对稳定。nsp12-nsp7-nsp8复合物的阴性染色电镜可视化观察显示出具有良好均匀性的分散颗粒。对于apo形式下的nsp12-nsp7-nsp8复合物，这些研究人员在洗涤剂DDM的存在下，对这种复合物样本进行了玻璃化处理。对图像处理的初步尝试显示，这些颗粒是优先取向的。因此，他们收集了超过570万个颗粒的7400多个显微影像，以增加非优先取向的投影数量。其中，81494个颗粒被用于产生2.8埃分辨率的密度图。 nsp12-nsp7-nsp8与模板-引物RNA和RTP结合在一起（称为template-RTP RdRp复合物）时的低温电镜研究面临两个挑战。首先，大多数颗粒被吸附到低温电镜网栅条上，而不是停留在玻璃态冰中。其次，在低温电镜样本制备的条件下，RNA双链可能从template-RTP RdRp复合物中解离下来。最终，这些研究人员制备出15mg/ml的template-RTP RdRp复合物样本用于低温电镜实验，这一浓度远高于可溶性蛋白复合物在低温电镜研究时所使用的正常浓度。这种template-RTP RdRp复合物的高浓度具有质量作用效应，以稳定这种RNA-蛋白复合物，并且让过量的template-RTP RdRp复合物逃避低温电镜网栅条的吸收，从而进入玻璃态冰中。他们收集了2886个显微影像，从而利用130386个颗粒投影产生了2.5埃分辨率的结构。由于这种解析出的结构的相对较高的分辨率，这种低温电镜图清晰地显示了这种复合物的关键结构特征。 RdRp复合物在apo形式下的结构包含一个nsp12、一个nsp7和两个nsp8，整体排列与SARS-CoV和最近解析出的SARS-CoV-2中的结构相类似（图2，A和B）。与SARS-CoV RdRp结构不同但与最近解析出的SARS-CoV-2 RdRp结构相似的是，这种结构显示nsp12还包含一个N末端的β-发夹（残基31～50）和一个延伸的套病毒RdRp相关核苷酰转移酶结构域（NiRAN，残基115-250），此外还有7个螺旋和3个β链。在NiRAN结构域之后是一个由3个螺旋和5个β链组成的界面结构域（残基251-365），该界面结构域与RdRp结构域（残基366-920）相连（图1A和2B）。nsp12的RdRp结构域显示出典型的杯状右手构象，手指亚结构域（残基397-581和残基621-679）与拇指亚结构域（残基819-920）形成一个封闭的环形结构（图2，A和B）。这种封闭构象通过nsp7和nsp8的结合而变得稳定，其中一个nsp8分子位于手指亚结构域的顶部，并与界面结构域相互作用。nsp12的封闭构象可通过nsp7-nsp8异源二聚体进一步稳定化，这种异源二聚体沿着拇指-手指亚结构域界面堆积（图2，A和B）。此外，这些研究人员能够在由H295-C301-C306-C310和C487-H642-C645-C646组成的保守性金属结合基序中配位两个锌离子（图2C），这一点在SARS-CoV RdRp结构中也能观察到。这些锌离子很可能是维护RdRp结构完整性的保守结构成分。 图2.apo形式下的nsp12-nsp-7-nsp8 RdRp复合物的低温电镜结构。 template-RTP RdRp复合物的结构包含一个nsp12、一个nsp7和一个nsp8（图3，A和B）。第二个nsp8在template-RTP复合物的低温电镜图中基本看不到，因此没有包含在最终的结构模型中。此外，template-RTP RdRp结构含有位于模板链中的长14个碱基的RNA，位于引物链中的长11个碱基的RNA、与引物链共价连接在一起的抑制剂RMP（图3，C和D），以及一个焦磷酸和三个镁离子，这些镁离子可能作为活性位点附近的催化离子（图3D）。 图3.RdRp复合物与瑞德西韦与RNA结合在一起时的低温电镜结构。 template-RTP RdRp复合物的整体结构与apo形式下的RdRp结构相似，nsp12处于封闭构象（图2A和3A）。由来自模板-引物RNA的11个碱基对形成的双链RNA螺旋（图3C和4，A至E），由手指-手掌-拇指亚结构域握着。在模板-引物RNA和nsp12之间观察到广泛的蛋白-RNA相互作用，共有29个来自nsp12的残基直接参与RNA的结合（图4E）。令人惊讶的是，尽管nsp7和nsp8这两种蛋白是RdRp结合RNA所需要的，但是它们并不介导RNA相互作用。大多数蛋白-RNA相互作用涉及RNA磷酸-核糖骨架，许多相互作用直接发生在2′-OH基团上（图4E），从而为区分RNA与DNA提供了基础。nsp12与模板-引物RNA的任何碱基对都没有接触，这表明序列独立于DNA的生物碱基对。nsp12与模板-引物RNA的任何碱基对都没有接触，这表明RdRp与RNA的结合与序列无关。这与RdRp在延伸阶段的酶活性不需要特定的序列这一事实是一致的。 位于引物链的3′端是RMP（图3D和图4，D和E），RMP在+1位点共价整合到引物链上（图4E）。在模板链的+2和+3位点上的核苷酸与来自手指亚结构域背面的残基相互作用（图4，A和B）。尽管在复合物组装中存在过量的RTP，但从这种复合物结构中观察到，只有单一的RMP被组装到引物链上。因此，瑞德西韦和许多核苷酸类似物前体药物一样，通过非专一性RNA链终止机制抑制病毒RdRp活性，这一机制需要瑞德西韦转化为它的活性三磷酸形式。 图4.RdRp复合体识别RNA。 RMP的结合位置位于催化活性位点的中心（图3D）。作为一种单磷酸腺苷类似物，RMP与来自引物链的上游碱基形成碱基堆积相互作用，并且与来自模板链的尿苷碱基形成两个氢键（图3D）。此外，RMP还与K545和R555的侧链发生相互作用。在结合的RMP附近有两个镁离子和一个焦磷酸。这两个镁离子与磷酸二酯骨架相互作用，它们是催化活性位点的一部分。焦磷酸位于活性位点的核苷酸进入通道的通道口，可能阻断核苷酸三磷酸进入活性侧（图3，C和D）。 nsp12 RdRp的催化活性位点由A到G的7个保守性基序构成（图1A和3E）。来自手掌亚结构域的基序ABCD和基序C中的SDD序列（残基759-761）形成催化活性中心（图3D）。D760和D761都参与了催化中心中的两个镁离子的配位。基序F和G位于手指亚结构域内，它们与模板链RNA相互作用，并引导该链进入活性位点（图3E）。基序F中与+1碱基相接触的K545和R555侧链与引物链RNA相互作用（图3D），从而将进入的核苷酸稳定在正确的位置上进行催化。模板-引物RNA在活性位点中的的定位类似于模板-引物RNA在脊髓灰质炎病毒RdRp延伸复合物和HCV NS5B RdRp抑制复合物中的定位。参与RNA结合的残基以及包含催化活性位点的残基都是高度保守的，这突出了RdRp在这些不同的RNA病毒中的保守性基因组复制机制，并表明有可能开发出广谱抗病毒抑制剂，如瑞德西韦和加利德韦（galidesivir, 也称为BCX4430）。 结构比较发现了apo形式下的RdRp复合物和template-RTP RdRp复合物结构之间的几个有趣的差异（图3，E和F）。首先，nsp7向RdRp核心移动了1.5埃（如nsp7残基F49所测得的那样），导致界面重排，结果就是复合物中第二个nsp8的结合力减弱。第二，连接拇指亚结构域的第一螺旋和第二螺旋的环状结构向外移动了2.8埃（如nsp12残基I847所测得的那样），以容纳双链RNA螺旋的结合（图3F）。第三，基序G残基K500和S501也向外移动2.0埃，以容纳模板链RNA的结合。除了这些变化之外，apo形式下的nsp12和template-RTP RdRp复合物中的nsp12非常相似：整个蛋白中所有Cα原子的均方根偏差（root mean square deviation, rmsd）为0.52埃。特别是构成催化活性位点的结构元素可以完全叠加（图3E），这表明SARS-CoV-2 RdRp是一种相对稳定的酶，当与RNA模板结合后，就可以发挥复制酶的功能。病毒RdRp是一种高度进行性的酶，其复制速度可达100个核苷酸/秒。apo形式下的结构和活性酶结构之间没有明显的构象变化，这与病毒RNA聚合酶的较高持续合成能力相一致，因而在复制周期中不需要消耗额外能量来导致活性位点发生构象变化。 除了瑞德西韦之外，一些核苷酸类似物药物，包括法匹拉韦（Favipavirir）、利巴韦林（Ribavirin）、加利德韦（galidesivir）和EIDD-2801，在细胞实验中有效地抑制SARS-CoV-2复制。与瑞德西韦一样，这些核苷酸类似物也被提出通过非专一性RNA链终止机制抑制病毒RdRp，这种机制需要前体化合物转化为它们的三磷酸活性形式。template-RTP RdRp复合物的结构提供了一个很好的模型来合理地思考这些药物如何抑制SARS-CoV-2 RdRp活性。特别是，EIDD-2801在阻断SARS-CoV-2复制方面比瑞德西韦强3～10倍。胞苷环外的N4羟基与K545的侧链形成一个额外的氢键，而胞苷碱基也与模板链上的鸟嘌呤碱基形成一个额外的氢键。这两个额外的氢键可能解释了EIDD-2801在抑制SARS-CoV-2复制方面具有明显更高的效力。 COVID-19大流行已经在全球范围内造成了情感上的痛苦和经济负担。对病毒生命周期至关重要的酶，因其与宿主蛋白不同，是很好的抗病毒药物靶点。在病毒酶中，RdRp是现有许多核苷酸类药物的主要靶点。在这篇论文中，这些研究人员报道了SARS-CoV-2 RdRp复合物的apo形式以及与模板-引物RNA和活性形式的雷德西韦结合在一起时的结构。这些结构揭示了模板-引物RNA是如何被这种酶识别的，以及瑞德西韦如何抑制链的延伸。结构比较和序列比对表明，RdRp识别底物RNA和瑞德西韦抑制RdRp的模式在不同的RNA病毒中高度保守，这为设计基于核苷酸类似物的广谱抗病毒药物提供了基础。此外，这些结构为现有的核苷酸类药物（包括强效的EIDD-2801）的建模和修饰提供了一个坚实的模板。总之，这些观察结果为设计更强效的抑制剂来对抗SARS-CoV-2的恶性感染提供了合理的基础。（生物谷 Bioon.com） 参考资料： Wanchao Yin et al. Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir. Science, 2020, doi:10.1126/science.abc1560.
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