美国罗切斯特大学基于双光子荧光显微镜(TPFM)成功设计了一种实时成像系统，该系统能够通过对未经处理的新鲜组织活检，快速诊断非黑色素瘤皮肤癌。非黑色素瘤皮肤癌的TPFM成像能够在几分钟内得出活检指标，通过该系统获得的组织学特征可与传统组织学相媲美。基于 TPFM 的成像系统也可用于诊断皮肤癌或者其他皮肤病。因为系统的即时性诊断，患者可以在确诊后及时得到治疗，无需长时间等候和复诊。
TPFM 使用的近红外光可以穿透人体组织，从而对形状不规则的活检组织快速成像，有效避免了传统检测技术繁杂的前期准备工作。系统所生成的图像不仅具有高分辨率，而且还能实现虚拟染色，从而便于观察。
图 基于双光子荧光显微镜系统的组织活检图像
传统的皮肤活检获得诊断结果通常需要几天的时间，相比之下，TPFM 成像系统可以同时对多个组织标本进行实时检测，实现快速诊断，能够有效抓住治疗时机，并且降低治疗成本。
Michael Giacomelli 教授表示，自从19世纪末以来，医院一直采用的是传统的活检方式，并且已经完成了数以亿计的活体组织检查。虽然传统的检测技术非常有效，但是速度却很慢。
在临床TPFM 测试中，研究人员使用波长为1040 nm的激光扫描组织标本，并以16 f/ps 的速度激发荧光。此时荧光团发射的荧光被分离并过滤为518- 558 nm和620- 680 nm波段。然后通过两个硅基光电倍增器分别检测两个荧光通道，它能够实现高速、高信噪比成像。
TPFM所使用的显微镜独立安装在一个不透光的外壳中，因此可以在有灯光的房间里进行成像。激光器、显微镜、控制器和计算机被集成在一起并安装在一个移动推车上。
为了比较 TPFM 与传统组织学诊断性能，研究人员对29例接受治疗的非黑色素瘤皮肤癌病变患者新切除的活检进行了测试。他们获得切除后组织切片的数字 TPFM 图像后与相应的H&E切片图像进行比较评估。其中12个共配对图像被用作训练集。15个图像经过皮肤病理学家评估后被用于蒙面评估，2组图像被排除在研究之外。在对15个已知的非黑素瘤皮肤癌活检进行测试时，该技术检测出基底细胞癌，灵敏度和特异性均为 100%，鳞状细胞癌的灵敏度为 89%，特异性为 100%。
研究人员表示，与冷冻切片或石蜡切片相比，TPFM 可以在2到3分钟内完成组织学评估新鲜组织标本，而且不需要组织病理学实验室或专业人员。虽然TPFM 相比其他荧光成像技术能够成像更深，但其仍然限制在大约100微米的组织内。然而，就像传统组织学那样，组织标本可以被分割成两部分平分或面包状，以暴露内部组织进行成像，从而消除了更深层成像的需要。
TPFM成像系统的尺寸比冷冻切片机更小，便于携带，与标准组织处理相比，减少了人员配置。这使得即使在资源匮乏的环境下，也可以实时、即时地对皮肤活检进行测试。而且它的成像是非破坏性的，染色剂通过石蜡化去除；因此，组织样本后续还可以进行组织学或免疫组化。
Giacomelli 认为该系统有望快速提供一系列疾病的活检结果。比如，在前列腺病例中，外科医生从x光片或核磁共振成像能够获得的有效信息非常有限。但是有了这项技术，为随时调整患者治疗方案提供了可能。
研究结果表明，TPFM 有潜力作为一种快速、即时诊断工具，不需要准备大量的组织样本或着专业的图像评估专业人员。尽管如此，仍有必要在更大的群体中进一步验证TPFM成像，以全面评估其诊断准确性。Giacomelli正与Sherrif Ibrahim教授合作进行一项200人的后续研究，使用随机抽取的活检样本。
Giacomelli 表示，他们目标是分析这项技术在实际情况中的应用效果。毕竟实际场景十分复杂，各种各样的情况都可能出现。如果想要保证诊断结果的准确性，必须要确保不能混淆与癌症无关的东西。因为一旦开始对人们进行随机活检，你永远不知道你会发现什么。
与此同时，Giacomelli 还参与了一项平行研究，他想要确认他开发的一种融合了 TPFM 和视频的新系统能否用于指导手术。该系统将组织被切除部位的 TPFM 图像叠加在网络摄像头图像上，将肉眼看到的图像与在幻灯片上处理后的图像进行共同匹配。他提到，“通过这款系统，你可以展示切除的组织是什么样子的，以及肿瘤在切除部位的位置。然后可以将其映射到伤口中，以决定到底切除哪一部分。”
