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《Science | 在哺乳动物细胞中进行罕见密码子重编码以实现高效的非规范氨基酸整合》

  • 编译者： 李康音
  • 发布时间：2024-06-14

  • 2024年6月6日，浙江大学林世贤团队在Science 在线发表题为Rare codon recoding for efficient noncanonical amino acid incorporation in mammalian cells的研究论文。

    基因编码非规范氨基酸(ncAAs)的能力使蛋白质具有改进的或以前未知的特性。然而，哺乳动物细胞中的现有策略依赖于引入空白密码子来结合ncAAs，这是低效的，并且限制了它们的广泛应用。

    该研究开发了一种罕见密码子编码策略，利用TCG密码子的相对稀缺性，通过系统工程和大数据模型预测实现高选择性和高效的ncAA结合。该研究强调了该策略在野生型蛋白表达水平上将数十种ncAAs整合到各种功能蛋白中的广泛应用，以及在哺乳动物细胞中合成具有多达六位点ncAAs或四种不同ncAAs的蛋白以供下游应用。

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相关报告

  • 《Cell丨用合理设计的 R2 反转座子在哺乳动物细胞中进行全 RNA 介导的定向基因整合》
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2024-07-12
    • 2024年7月8日，中国科学院动物研究所/北京干细胞与再生医学研究院李伟研究员与周琪研究员团队合作在Cell杂志以长文形式在线发表了题为All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons的研究论文。该研究结合基因组数据挖掘和大分子工程改造等手段，开发了使用RNA供体进行大片段基因精准写入的R2逆转座子工具，能够在多种哺乳动物细胞系、原代细胞中实现大片段基因（>1.5 kb）高效精准的整合，最高效率超过60%，成功实现了全RNA介导的功能基因（DNA）在多种哺乳动物基因组的精准写入，为新一代创新基因疗法的发展提供了基础。 在该研究中，研究团队首先通过数据挖掘，全面系统地分析了自然界中R2逆转座子元件的生物多样性；通过构建基于RNA供体的基因写入的报告体系，成功筛选出在哺乳动物细胞中具有完整GFP功能基因整合活性的R2Tg系统（来源于一种鸟Taeniopygia guttata 的基因组）。随后，研究团队针对R2Tg系统发挥功能所必需的两个关键组分：R2蛋白质以及供体RNA，进行了系统性的功能探索与工程化改造，最终获得了在人细胞系中基因整合效率超过20%的en-R2Tg工具。 由于R2蛋白质可以通过mRNA表达，且供体RNA本身也是RNA，那么，en-R2Tg工具能否以全RNA形式介导的基因的高效精准写入？为了探究这一点，研究人员通过体外合成获得了编码R2蛋白质mRNA以及供体RNA，并使用脂质体递送的方式将两条mRNA导入人的细胞中。结果显示，en-R2Tg工具能够高效整合多个与疾病治疗相关基因，且这些基因能够有效表达功能蛋白。能够以全RNA的形式发挥功能，意味着en-R2Tg工具可以使用安全性已经在临床上得到证明的LNP纳米材料来进行递送，这将有可能解决长久以来基因写入工具依赖病毒载体进行高效递送的难题。研究团队发现，使用LNP递送en-R2Tg工具在人的肝脏细胞系中能够实现25%的基因整合效率。此外，研究团队还证明R2工具在人类原代细胞中同样具有活性；同时，通过显微注射将en-R2Tg工具导入小鼠胚胎，成功实现了超过60%的GFP基因定点整合效率。 该研究的另一关键点在于，工程化改造的en-R2Tg工具是否还保留有天然R2逆转座子的28S rDNA位点特异性整合这一性质？为了回答这一问题，研究人员结合无偏好的基因整合富集高通量测序以及全基因组三代测序方法，发现en-R2Tg工具在全基因组范围内展现了极高的基因整合特异性，大于99%的外源基因都精准整合到28S rDNA安全港位点。同时，结合qRT-PCR以及RNA-Seq实验，研究人员发现en-R2Tg工具对细胞的转录组状态几乎没有影响。这说明 en-R2Tg 介导的基因写入是位点精准特异的，可以有效避免逆转录病毒等技术所产生的基因随机整合导致的基因突变风险。 综上，该研究基于自然界存在的R2逆转座系统，结合数据分析和工程化改造方法，成功开发了全RNA介导的、高效精准的基因写入技术，首次在多种人和小鼠细胞系及原代细胞中实现了功能基因的定点整合。R2基因精准写入工具在递送和安全性方面具有显著优势，未来有望基于此工具开发在体功能基因回补写入以及在体生成CAR-T细胞等全新的疾病治疗方法。值得注意的是，R2基因写入技术目前无法实现在不同基因组位点的可编程写入，且在人原代细胞中的基因写入效率较低，因此未来需要进一步发展和优化。
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  • 《述评 | 细胞化学重编程》
    • 来源专题：战略生物资源
    • 编译者：李康音
    • 发布时间：2023-09-28
    • 2023年8月7日，浙江大学祝赛勇团队在Nature Cell Biology上发表题为A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state的论文。该研究通过大规模的小分子筛选，对重编程步骤加以进一步细分，让化学重编程的速率得到大幅提升，甚至接近转录因子重编程的速率，借此提供了一个全新的快速化学重编程体系（FCR，fast chemical reprogramming）。 一方面，这有助于探索化学重编程乃至细胞命运重塑的机制；另一方面，他们也成功找到多个调控细胞命运转换的小分子药物，从而有望用于再生、抗纤维化甚至抗衰老。其中，FCR 的建立能够极大加速对于细胞命运决定与转换分子机制的研究。多能性重编程作为细胞命运调控的核心体系，对其进行深入研究和理解，可以揭示细胞命运决定与细胞命运转换的底层逻辑，从而破解细胞身份密码、逆转发育时钟，有望实现多重应用场景。就重编程技术本身而言，此次筛选出来的小分子有望促进人细胞化学重编程或其他细胞类型之间的转变，从而帮助获得效率更高、质量更高的种子细胞或功能细胞，进而用于再生医学、疾病建模和药物筛选。此外，就小分子本身而言，其中一部分小分子或小分子鸡尾酒可以提高细胞的可塑性，故可用于向损伤部位进行局部用药，通过刺激细胞再生来实现治疗目的。同时，基于细胞重编程原理衍生的抗衰老应用也很值得期待。 化学重编程有何不同？ 细胞重编程，是细胞生物学和发育生物学的核心科学问题之一，近百年以来，该领域诞生了众多激动人心的划时代科技进展，比如克隆、诱导多能干细胞、化学重编程等。目前，人们对于细胞重编程分子机理的认知仍然存在很多不清晰的地方。虽然传统转录因子重编程和化学因子重编程的起点和终点是一致的，例如从皮肤细胞重编程到诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC）。但是，传统转录因子重编程和化学因子重编程两者之间的路径却不尽相同。打个比方，一个人从杭州到北京，既可以通过京杭大运河坐船到达，也可以乘飞机或坐高铁。转录因子重编程，采用直接过表达外源多能性转录因子的方式，比如 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 等转录因子。这些转录因子具有结合 DNA 能力，会结合到基因组的很多位点，从而能够关闭起始细胞的基因表达网络，同时能激活内源的多能性基因表达网络，进而实现 iPSC 的诱导。而化学重编程使用的是靶向信号通路、表观遗传和细胞代谢的化学小分子组合，借此模拟外界环境的刺激，进而逐步激活内源多能性基因表达网络。当利用这种手段时, 细胞的命运重塑较为曲折。也有观点认为，化学重编程与蝾螈等肢体再生过程十分类似。 而该团队提出的快速化学重编程（Fast chemical reprogramming, FCR）体系，其基于更加精准动态的诱导方式，总共采用 6 步法。当采用这种方法时，该课题组观察到很多早期发育相关基因会被激活，进而参与目标细胞的基因激活、以及细胞命运的转换过程，这一过程更加类似于发育程序的细胞身份转变。 化学重编程发展现状如何？ 从技术角度而言，化学重编程已被证明是可行的，并且能够用于不同胚层来源细胞或用于不同遗传背景的细胞。而该团队此次提出的新方法，首次实现并证明化学重编程在速率上能够接近传统转录因子重编程。从机制角度而言，此前已有研究报道过化学重编程的单细胞转录组数据或表观组数据。而本次研究则系统性地整合了转录组学、以及包括多个组蛋白修饰和 DNA 甲基化修饰的表观组学数据，从宏观层面为化学重编程机制研究打下了基础。然而，由于小分子靶点的多样性以及细胞命运重塑的复杂性，多个小分子组合到底以怎样的方式产生协同作用？以及如何正确地将细胞引向多能性重编程？对于背后的具体机制，学界依然不甚清晰。目前，化学重编程实验的对象主要是小鼠成纤维细胞，所以该类实验需要在细胞水平进行。由于技术原因、以及动物体内环境的复杂性，当前很难在动物体内实现精准的小分子组合靶向递送。有意思的是，早年已有学者利用转录因子，在小鼠体内进行部分重编程。另有学者利用病毒载体向小鼠眼部，以特异性的方式实现重编程因子瞬时过表达，从而成功逆转小鼠视网膜神经细胞的衰老，并恢复了衰老小鼠和青光眼小鼠的视力，证明多能性重编程本身具有激活细胞潜能的作用。那么，类比到化学重编程，或许也能针对衰老或损伤部位，以药物组合靶向递送的方式，来增加细胞的可塑性，从而刺激细胞再生，进而实现原位组织再生。 从国内到国外，跨越 15 年的一系列研究 事实上，早在 2008 年即在诱导多能干细胞（iPSC）技术诞生不久之后，祝赛勇就投身到细胞重编程的化学小分子筛选之中，并于 2010 年在 Cell Stem Cell 上发表论文，率先报道了利用单个转录因子和小分子组合实现细胞重编程的成果。2015 年，回国建立独立实验室之后，他立马搭建实验平台，就是希望能够建立高效、快速的化学重编程。 2016 年，刚启动筛选测试的时候，他和团队就遇到一个棘手难题。实验所需的细胞严重不足，于是他们赶紧从外部公司购买 Oct4-GFP 小鼠。然而当他们第一次取出成纤维细胞并进行化学重编程时，却几乎没有出现荧光，这让课题组既着急又困惑。一开始，他们怀疑是技术不稳定的原因。后来，才发现相比 OG2 品系小鼠，Oct4-GFP 品系小鼠由于报告基因拷贝数较少的原因，因此荧光会弱很多。但在当时他们已经开始进行大规模小分子筛选，原有的 OG2 成纤维细胞数量告急，眼看着课题即将停滞。后来经过多方努力，他们才解决了细胞来源问题。时间很快来到 2018 年，当时课题已经取得了不错进展。这时，重编程的优化已经接近 14 天。与此同时，也面临竞争压力。“好在课题组一起积极调整心态，坚持自己的步伐，又经过一年的筛选和优化，建立了时间周期为 12 天的体系。这时，大家反而沉下心，又花了大半年时间，尝试了所有能做的测试和优化，才建立了目前时间周期最快为 1 周的 FCR 体系。”祝赛勇说。 2019 年，在 FCR 系统构建成功之后，课题组成员非常好奇系统之中具体发生了什么。为此，他们先是进行了转录组测序。可是，在对转录组测序进行常规分析之后，还是一直理不出头绪。于是，在对重编程过程中的转录组数据进行两两比较之后，他们意外发现 FCR 后期经历了一个“滞育”类似状态。胚胎滞育，是指哺乳动物的胚胎在应对外源环境或激素作用下，发生胚胎的新陈代谢减缓甚至停滞，期间伴随着胚胎植入的滞后。而在退出滞育状态之后，胚胎仍然可以正常发育成为完整个体。此次研究发现：在 FCR 后期细胞的基因表达模式，类似于体内滞育囊胚的基因表达模式，包括下调与细胞分裂和蛋白质合成的相关通路。实验中，课题组证明 FCR 后期细胞的 DNA 和蛋白质的合成速率显著下调，这证明了滞育类似状态的存在。有趣的是，在对相关数据进行对比之后，他们发现滞育类似状态是 FCR 后期一种独特的状态。当对滞育类似状态进行抑制之后，则会导致重编程效率的显著下降。 此后，如何分析和关联大规模多组学数据成了最大的难题。2021 年底，经过所有组员的努力终于发现了 H3K9me3 修饰的独特之处，并分析得出如下结论：H3K9me3 会抑制多能性相关的 ERV，从而调控重编程的机制。H3K9me3，是一种可以抑制细胞多能性重编程的异染色质修饰。然而，以往关于 H3K9me3 在细胞重编程的研究，主要集中于研究它对基因的调控作用。而在本次研究之中，他们发现 H3K9me3 主要能够修饰基因组上 ERV 富集的基因稀疏区域。通过一番筛选，他们找到多个受到 H3K9me3 抑制的多能性相关 ERV，这些 ERV 在 FCR 后期会被显著激活。 实验中，该团队进一步证明 H3K9me3 会通过抑制多能性相关 ERV，从而形成重编程的障碍。这一机制的发现，再次说明在细胞命运转变过程之中，表观遗传修饰可以通过调控 ERV 表达，从而影响细胞身份的建立。此外，通过研究化学重编程的全过程，该团队提供了高质量的转录组学数据和表观组学数据。通过这些数据他们系统性地描绘了 FCR 过程中细胞基因表达动态和表观遗传动态。 再生研究，永无止境 除本次成果之外，该团队在过去也积累了不少其他成果。课题组还表示：“近年来，我们实验室深耕化学重编程领域，在 Nature Cell Biology、EMBO J、PNAS 上连发多篇论文。下一步我们将集中精力，针对在这些研究中最新筛选的多个小分子，对其作用机制进行探究。”与此同时，该团队在干细胞基因编辑和胰岛前体细胞高效扩增及分化（ePP-islet）上也取得了一些进展，相关论文此前相继发表在 Science 子刊和 Nature 子刊。在这一系列研究中，课题组采用了多种筛选方法，一方面他们参考已有文献中报道的小分子，另一方面则大规模地自行筛选小分子文库。 目前，利用直接模仿转录因子的方法，来设计化学小分子依旧比较困难。不过，利用化学小分子直接或间接调控转录因子，是一个可行的有效方案。例如，利用小分子可以直接激活内源转录因子，从而促进化学重编程。在实践中，尽管广谱盲选的手段既耗时又耗力，不过这依然是目前比较有效的手段，并能帮助发现一些有趣的分子机制。未来，随着人工智能、虚拟筛选等新技术的发展，必将助力实现通量更高、效率更高的小分子高通量筛选。可以想象的是，将来只需从病人身上取少量血液细胞，利用快速化学重编程技术，即可将其转变成可无限扩增的种子细胞，甚至可以通过基因编辑技术进行改造，再定向分化到具备生理功能的胰岛，从而有望治愈糖尿病。 整体来看，细胞重编程是一个非常神奇的生物学过程，蕴含着无限潜能，但是仍有很多未解的奥秘。再生和返老还童，是古老而又永恒的人类梦想与追求，这条道路永无止境，等待科学家们进一步的探索。 本文内容转载自“ DeepTech深科技”微信公众号。 原文链接: https://mp.weixin.qq.com/s/LfOTtL5bwFfXJN2UWzSHaQ
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