《发现一种广谱的CRISPR/Cas9抑制剂》

  • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者: huangcui
  • 发布时间:2017-12-18
  • 如果说CRISPR复合物听起来很熟悉,那是因为它们是新一波基因组编辑技术的最前沿。CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统,被用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

    在CRISPR/Cas系统中,CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的简称,涉及细菌基因组中的独特DNA区域,也是储存病毒DNA片段从而允许细胞能够识别任何试图再次感染它的病毒的地方,CRISPR经转录产生的RNA序列(被称作crRNA)识别入侵性病毒的遗传物质。Cas是CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)的简称,Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割细菌基因组上的靶DNA。科学家们已发现他们能够利用CRISPR降解病毒RNA的天然能力,并且使用CRISPR系统从几乎任何一种有机体中移除不想要的基因。

    目前已在细菌中发现三类CRISPR/Cas系统,I型和III型系统需要众多蛋白的参与。II型系统就简单得多了,一个Cas9核酸酶利用向导RNA(gRNA)就可以完成识别和切割靶双链DNA,因此II型系统也被称作CRISPR/Cas9系统。

    在细菌的免疫系统中,CRISPR-Cas9的作用是靶向结合和摧毁侵入性的DNA,并且被作为一种稳健的基因组编辑技术加以使用。噬菌体编码的小分子抗CRISPR蛋白(anti-CRISPR proteins, Acr)能够让Cas9酶失活,从而为基于Cas9的应用提供一种高效的关闭开关。

    在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校、马萨诸塞大学医学院、哈佛医学院和加拿大多伦多大学的研究人员证实两种Acr蛋白,即AcrIIC1和AcrIIC3,利用不同的策略抑制Cas9。相关研究结果发表在2017年9月7日的Cell期刊上,论文标题为“A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9”。

    AcrIIC1是一种广谱Cas9抑制剂,通过直接结合到Cas9的保守性HNH催化结构域上,阻止多种有差异的Cas9直系同源物切割DNA。AcrIIC1-Cas9 HNH结构域复合体的晶体结构展示了AcrIIC1如何将Cas9限制在一种DNA结合的但是没有催化活性的状态。相反,AcrIIC3阻断单个Cas9直系同源物的活性,诱导Cas9形成二聚体,从而阻止Cas9结合到靶DNA上。

    这两种不同的机制允许独自地控制Cas9的靶标DNA结合和切割,而且也为开展允许Cas9结合到靶DNA上但阻止它切割DNA的应用铺平道路。

  • 原文来源:http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30873-5
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    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2019-05-13
    • 在一项新的研究中,来自美国布罗德研究所等研究机构的研究人员发现酿脓链球菌Cas9(SpCas9)的首批小分子抑制剂能够更精确地控制基于CRISPR-Cas9的基因组编辑。具体而言,他们通过开发一系列高通量生物化学分析方法和基于细胞的分析方法,筛选了许多小分子,以便鉴定出能够破坏SpCas9与DNA结合因而干扰它的DNA切割能力的化合物。这些首批小分子CRISPR-Cas9抑制剂很容易进入细胞,并且比之前发现的抗CRISPR蛋白小得多。这些新化合物可以对基于SpCas9的编辑技术进行可逆的和剂量依赖性的控制,包括它们在哺乳动物细胞中进行基因编辑、碱基编辑和表观遗传编辑的应用。相关研究结果发表在2019年5月2日的Cell期刊上,论文标题为“A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9”。 论文通讯作者、布罗德研究所的Amit Choudhary说道,“这些技术为快速鉴定和使用针对SpCas9和下一代CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂奠定了基础。靶向CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂具有广泛应用于基础研究、生物医学和国防研究以及生物技术应用的潜力。” 当前,SpCas9正在开发作为多种疾病(包括艾滋病、视力障碍、肌肉萎缩症和其他遗传性疾病)的基因治疗试剂。但是,这些治疗应用将极大地受益于对SpCas9活性的剂量和时间安排进行精确控制以减少脱靶效应。控制SpCas9活性的这些方面也可能使其他应用受益,比如对模型生物的DNA进行高效编辑来构建疾病模型和研究疾病,以及在基因工程蚊子中使用基因驱动来遏制疟疾和其他蚊子传播疾病。 对SpCas9的剂量和时间控制的需求已产生了对抗CRISPR分子的需求。尽管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白,但是它们是大分子,不易渗透到细胞中,起着不可逆的作用,可被蛋白酶分解,并且可能在体内存在引起不良免疫反应的风险。相反,小分子抑制剂在蛋白水解上是稳定的,可逆的,通常是非免疫原性的,并且能够通过被动扩散轻松地递送到细胞中。此外,它们可以低成本地大规模合成,具有很小的批间差异。 在这项新的研究中,Choudhary及其团队推出了一个强大,灵敏且可扩展的平台,用于快速、经济地鉴定和验证SpCas9的小分子抑制剂。鉴于SpCas9酶的特性,以高通量方式测量CRISPR-Cas9活性从而进行药物筛选一直是具有挑战性的。为此,Choudhary团队分别开发了针对SpCas9-DNA结合和SpCas9 DNA切割活性的高通量初级和二级测定方法。对于初级测定,他们使用一种称为荧光偏振的生物化学技术来监测SpCas9与含有PAM序列的经过荧光团标记的DNA片段之间的相互作用。在二级测定中,他们使用自动显微镜来测量在细胞中由SpCas9介导的对报告基因进行DNA切割后产生的荧光变化。 通过使用这些测定方法,这些研究人员首先筛选了多种类型小分子的代表成员,以确定其成员经常抑制SpCas9的小分子类型。他们鉴定出两种先导化合物,它们以剂量依赖性方式破坏了哺乳动物细胞中SpCas9结合DNA和抑制SpCas9介导的DNA切割的能力。鉴于这些小分子阻断这种酶结合DNA,因此它们还抑制SpCas9的催化活性受到破坏的编辑技术,包括用于转录激活的那些技术,而且在人血浆中是稳定的。 Choudhary说,“这些结果为对CRISPR-Cas9活性的精确化学控制奠定了基础,从而能够安全地使用这些技术。然而,这些分子还没有为人类应用做好准备,也没有在生物体内进行功效测试。” 在未来的研究中,这些研究人员计划鉴定这些抑制剂在SpCas9:gRNA复合物上的结合位点,研究它们的作用机制,并优化它们的功效。他们还将确定这些分子是否与哺乳动物细胞中的其他靶标相互作用,并评估它们对其他的CRISPR相关核酸酶的特异性。这项新研究的早期结果表明这些分子对它们的靶标极具特异性,这是因为它们对与SpCas9的亲缘关系较远的CRISPR相关酶Cas12a没有影响。
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    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2018-08-25
    • CRISPR/Cas9基因编辑技术可能有朝一日治疗目前被认为是无法治愈的疾病。负责切除致病性的DNA片段的Cas9蛋白长期留在体内是不安全的。这就是为什么科学家们正在寻找方法来缩短这种蛋白在消除它的靶标后停留在体内的时间。为了这个目的,在一项新的研究中,来自美国桑迪亚国家实验室的研究人员开发出首个同类型的测试方法,它能够廉价地快速准确地筛选数千种分子是否能够有效地关闭这种DNA切割蛋白。相关研究结果近期发表在Analytical Chemistry期刊上,论文标题为“Versatile High-Throughput Fluorescence Assay for Monitoring Cas9 Activity”。 DNA切割:我们如今能够观察它 CRISPR/Cas9基因编辑技术是建立在细菌的免疫系统之上的。通过使用一种俗称为CRISPR的系统,细菌能够保存来自入侵病毒的DNA片段。当病毒再次发起攻击时,Cas9蛋白经向导RNA(gRNA)招募后结合、切割和破坏病毒DNA。 科学家们如今能够像分子剪刀那样利用Cas9和gRNA移除发生突变的DNA序列,并能够校正遗传疾病。这为治疗从癌症到遗传疾病(如肌肉萎缩症和囊性纤维化)到病毒感染(如埃博拉病毒)等各种疾病打开了大门。 然而,Cas9在切割它的靶标后在体内停留的时间越长,就越有可能找到并切割不应被切割的类似DNA片段,这可能导致疾病。 找到在Cas9完成它的预定任务后能够关闭它的化学物的第一步是开发发现这些化学物的工具。桑迪亚国家实验室生物化学家Kyle Seamon解释道,他们开发出的这种测试方法将两种化学物放在一个DNA片段的两条相反的链上。在一条DNA链上,这种测试方法添加一个发出光线的荧光团(第一种化学物),而在另一条DNA链上,它添加一个吸收这个荧光团发出的光线的猝灭剂(第二种化学物)。 接下来,这种测试方法添加了一种潜在的Cas9抑制剂。如果这种抑制剂不起作用,那么Cas9将切割这个DNA片段,将这个荧光团与这个猝灭剂分离开来,从而使得这种测试方法在30分钟内发出明亮的光线。如果这种抑制剂有效地发挥作用,那么这种测试方法将不会发光。 不过在这种测试方法能够给出这种最终结果之前,这些研究人员必须添加一种能够导致Cas9从DNA上释放下来的化学物。Seamon说,“Cas9与DNA之间结合得非常紧密,即便DNA已被切割,它也会将切割后的DNA保持在一起。它不会放手。” 由于这个原因,很少有人开发出Cas9测试方法来测试DNA切割,而且也已存在的测试方法并不能够用于高通量应用中。这种新的测试方法一次可筛选一到两种化学物。通过这种方法,这些研究人员迄今为止已能够筛选将近20万种化学物抑制Cas9的能力,并鉴定出6种具有抑制效果的化学物。 继续寻找'关闭开关' 制药行业和农业行业对让基因编辑更安全非常感兴趣,而且世界各地的科学家们正为此采取多种方法。 天然存在的抗CRISPR是小蛋白。然而即便是小蛋白分子也是比较大的,因此如果不借助于单独的化学载体(如纳米颗粒),它们就不能被运送到细胞中进行治疗。鉴于蛋白运送,特别是抗CRISPR运送,是一个重要的生物技术目标,桑迪亚国家实验室的科学家们已集中精力开发能够将大分子运送到细胞中而不会引起任何不良反应的颗粒。 通过以各种方式寻找Cas9抑制剂,这些研究人员希望增加找到无副作用且可在小鼠和人体临床试验中制造和使用的抑制剂的可能性。当前,这些测试方法仅能够在体外的试管中开展。有朝一日,他们希望这些抑制剂将在世界各地的医生办公室中找到,同时开发出简单的治疗方法来治疗之前被认为是无法逆转的疾病。