2018 年 1 月 9 日，清华大学生命科学学院陈春来研究组在《Cell Reports》杂志发表了研究论文，题目为“The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET”（利用单分子 FRET 揭示 Cas9 在 DNA 切割过程中的动态构象）。该论文展示了 Cas9 可以自发地在三种主要构象中转换，揭示了 Cas9 蛋白与 PAM 远端 DNA/RNA 双链相互作用可长程别构调控 Cas9 切割结构域的局部构象，这是 Cas9 切割靶标 DNA 之前的最后校验步骤。最后，该文提出了优化和设计高保真 Cas9 的新思路，即通过突变 Cas9 蛋白以影响这种长程别构调控机制，可提高 Cas9 的识别特异性。
CIRSPR/Cas9 是一种可以由一条单链 sgRNA（single guide RNA）指导的利用 Cas9 核酸酶对靶向 DNA 进行特异性识别和切割的技术。由于其可以高效快捷地靶向切割 DNA 而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是，Cas9 的脱靶效应严重阻碍了其应用。尽管有一些研究报道了通过改造 Cas9 和截短 sgRNA 来提高其特异性，但仍然缺乏对 Cas9 切割靶标 DNA 的详细分子机制的全面认知，因而难以对 CIRSPR/Cas9 的优化提供系统性的指导。
单分子荧光共振能量转移技术（FRET）是检测生物大分子构象变化的有利工具。该研究通过在 Cas9 蛋白的特异位点上标记荧光团，基于全内反射荧光显微镜快速灵敏地捕捉单个 Cas9 分子的 FRET 效率变化以及在每个 FRET 状态的停留时间，以此反应 Cas9 的构象变化，并提供该过程中的一系列动力学参数。该研究发现，Cas9 展现出三种构象状态，并可以自发的在这三种状态中自由切换。靶标序列的 PAM 远端与 sgRNA 的大于三个碱基的错配，导致 Cas9 的 HNH 结构域（核酸切割结构域）稍偏离了其正确切割位点，因而将其从切割活性态转化为非活性状态。而这种对错配的校验机制是 Cas9 蛋白与 PAM 远端 DNA/RNA 双链相互作用对其 HNH 结构域的长程别构调控来实现的。
通过对 Cas9 一些高保真突变体的研究，该文章证明了在 Cas9/RNA/DNA 三聚复合物中引入额外的能量损耗导致 Cas9 切割底物的能垒升高，从而提高了 Cas9 切割特异性。该文章为优化 Cas9 特异性提供了新思路，即通过减弱 Cas9 与 PAM 远端 DNA/RNA 异源双链的相互作用来提高切割能垒，从而达到提高特异性的目的。
清华大学生命科学学院陈春来研究员为本文通讯作者。清华大学生命学院 CLS 项目三年级博士生杨梦铱，清华大学生命学院三年级直博生彭思佳为共同第一作者。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、清华 - 北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。
