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《Cell Res | 上海药物所合作发现科学界长期寻找的内质网阴离子通道》

  • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
  • 编译者： hujm
  • 发布时间：2023-05-09

  • 　内质网是细胞内重要的储存钙离子的细胞器，其通过膜上分布的三磷酸肌醇受体（IP3R）和兰尼碱受体（RyR）通道释放钙离子，并通过SERCA质子泵回收钙离子。钙离子跨内质网膜的流动带来电势的变化，需要其他离子进行电荷和渗透压的平衡。目前研究已证实内质网钾离子通道TRIC的存在，但一价的钾离子无法同时抵消二价钙离子释放产生的电势差和渗透压差，科学家因此推测内质网膜上必定同时存在一个阴离子通道。但该通道的神秘身份一直未被鉴定。

    　　2023年5月4日,清华大学医学院贾怡昌、中国科学院上海药物所高召兵与北医三院樊东升教授团队合作在Cell Research在线发表论文“Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel contributes to ALS-like pathologies”，首次证实了CLCC1是内质网定位的氯离子通道，具有协助内质网钙离子释放和调节内质网的离子稳态的生理功能；其功能缺失会破坏内质网的离子稳态，引发内质网胁迫并对肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理有贡献。该项研究揭开了科学界长期寻找的内质网氯离子通道神秘面纱。Cell Reseaerch同期发表评论性文章“Identity revealed for a long-sought ER anion channel”，其通讯作者迈阿密大学Laura Bianchi指出，该项研究发现了科学界长期以来寻找的内质网氯离子通道，并首次揭示其与肌萎缩侧索硬化症密切相关，可能是一个潜在的药物靶点。

    　　从全长序列看，CLCC1与已知Clic通道蛋白序列并无相似性，根据其内质网定位特征和电生理数据，研究人员建议将该基因重新命名为ER Anion Channel 1 (ERAC1)。为了研究CLCC1是否参与调节内质网的离子稳态，研究团队首先制备了内质网定位的比率型（ratiometric）氯离子探针和比率型钾离子探针。结合流式细胞术对293FT细胞进行检测发现，敲低CLCC1导致静息态[Cl-]ER和[K+]ER升高。透射电镜结果表明，不同于对照细胞中出现的细长且结合核糖体的内质网结构，CLCC1敲低的细胞出现更多的短棒状内质网，且内质网的平均宽度也会增加。因此，CLCC1维持着内质网中氯离子浓度和钾离子浓度，以及内质网的形态。

    　　在接下来的实验中，研究团队发现CLCC1功能缺失导致 [Ca2+]ER下降， 通过大量实验证明CLCC1对内质网钙离子释放是必要的。紧接着，研究团队发现磷脂酰肌醇PI(4,5)P2可以增加CLCC1的电导和开放概率，并揭示PIP2关键结合位点为K298。突变K298A降低通道功能及PIP2敏感性，而K298A敲入小鼠不仅在小脑出现内质网胁迫的信号和内质网膨胀的表型，而且脊髓中ChAT+运动神经元数量减少，并出现后腿无力的表型。在一个新的中国ALS病人队列中，研究团队发现了包括W267R和S263R在内的8个罕见突变。S263R和W267R经过单通道电生理，钙成像，基因敲入（knock-in）小鼠的病理学检测等一系列实验，证实为功能缺失的突变。K298A、S263R和W267R这三个knock-in小鼠品系内源CLCC1蛋白因更多的泛素化依赖的降解而出现表达量下降的特征，显示表型的严重程度依赖于CLCC1蛋白的表达量。在脊髓ChAT+运动神经元中条件性敲除CLCC1基因，小鼠出现内质网胁迫，泛素化蛋白聚集，TDP-43蛋白出核，运动神经元数量减少，和出生后一个月内快速死亡的表型。以上结果首次将CLCC1的突变与ALS联系起来，并暗示CLCC1可能是一个新的ALS致病基因。考虑到CLCC1同源多聚体的形成以及显性负效应（dominant negative effect）的存在，通过补充野生型CLCC1蛋白或者激活剩余的CLCC1的通道活性来治疗相应的疾病是一个可能的治疗手段。

    　　本研究在分子水平首次证实了CLCC1独立形成阴离子通道；在细胞层面提出阴离子通道调节内质网离子稳态的新假说：内质网腔的钙离子经过IP3R或者RyR通道释放到细胞质后，解除了对CLCC1的抑制，升高了内质网细胞质一侧的电势，驱动了氯离子经由CLCC1进入细胞质，同时TRIC释放钾离子进入内质网腔，从而达到电荷与渗透压的持续平衡。当CLCC1的功能缺失时，需要两倍于钙离子剂量的钾离子进入内质网来中和电势的短期变化，这升高了内质网腔的渗透压，导致内质网膨胀和内质网钙离子浓度的下降，激活了UPR；本研究使用多个CLCC1突变小鼠模型揭示了CLCC1表达剂量依赖的ALS发病新机制，支持了环境因素作用于遗传因素从而引起ALS的双重打击（two-hit）理论，为临床ALS疾病的治疗提供了新靶标和新思路。

    　　清华大学生科院/生命科学联合中心毕业生郭亮博士、上海药物所毛琼蕾博士和北京大学第三医院何及博士为论文的共同第一作者。清华大学医学院/生命科学联合中心贾怡昌教授、上海药物所高召兵研究员和北医三院樊东升教授为共同通讯作者。清华大学药学院肖百龙教授和刘晓玲博士，医学院朴学娇博士、罗莉博士、宋强博士，生科院本科生于涵之，上海药物所及浙江城市学院联合培养硕士生郝晓旭均有重要贡献。本工作获得了国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心、IDG/麦戈文研究所和北京市科委等支持。

    　　原文链接：https://doi.org/10.1038/s41422-023-00798-z

  • 原文来源：http://www.simm.ac.cn/web/xwzx/kydt/202305/t20230508_6750464.html
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  • 《Cell Reports | 上海药物所合作发现代谢物精胺调控表观遗传过程》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2023-07-20
    • 前列腺癌是男性癌症死亡的主要原因之一，死亡率仅次于肺癌。其中雄激素受体AR阳性前列腺肿瘤（AR positive prostate cancer, ARPC）为早期主要的前列腺肿瘤类型，靶向抑制AR的内分泌治疗是最主要的治疗手段，包括雄激素剥夺治疗、AR抑制剂治疗如恩杂鲁胺、阿帕鲁胺等。但是，随着内分泌治疗进行肿瘤会进展为致死性更高的去势抵抗性前列腺癌（Castration resistance prostate cancer, CRPC），对雄激素剥夺及AR抑制剂均显示出耐药性，其耐药机制中包括持续性AR剪接突变体（如Androgen receptor splice variant 7, AR-V7 ）的表达等。AR-V7缺少C端雄激素配体结合域，不与雄激素结合即可入核激活下游信号通路，因而不受靶向雄激素配体结合区的AR抑制剂的调控，解决CRPC的耐药问题并对其进行有效治疗成为临床上亟待解决的问题。前列腺是一类重要的分泌性器官，多胺代谢是其中一类重要的代谢类型，多胺类小分子主要包括腐胺、亚精胺、精胺。精胺在前列腺中含量最高，高出其他组织器官约10-20倍，癌组织中的精胺含量显著低于癌旁组织，且肿瘤恶性程度越高精胺含量越低，有研究者提出可以将精胺的含量作为判断肿瘤恶性程度的“biomarker”。以上现象均提示了精胺在前列腺肿瘤进展中的重要动能，但目前针对其潜在药理作用及分子机制的研究仍尚属空白。 　　针对以上问题，中国科学院上海药物研究所罗成课题组联合中国科学院分子细胞科学卓越创新中心高栋课题组，于2023年7月14日，在Cell Reports 上发表了题为“Spermine Is a Natural Suppressor of AR Signaling in Castration-Resistant Prostate Cancer”的研究成果。联合团队发现了精胺能够通过靶向抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT1，在基因组水平显著下调AR与靶基因的结合及AR靶基因的H3K27ac修饰水平，进而下调AR-FL、AR-V7信号通路，在去势抵抗性前列腺肿瘤CRPC中发挥抗肿瘤作用。 　　研究团队通过对多种前列腺肿瘤细胞或类器官进行精胺添加处理，结果显示精胺可以抑制肿瘤细胞生长，且对AR阳性CRPC生长抑制强度显著高于AR阴性CRPC。在同时表达AR-FL和AR-V7的CRPC细胞22RV1和VCAP中，精胺能够同时下调AR-FL和AR-V7的表达。RNA-seq结果显示，相比于恩杂鲁胺仅能够下调AR-FL信号通路，精胺能够同时下调AR-FL、AR-V7信号通路。AR是重要的转录因子，与靶基因的结合能够促进转录复合物的招募、增强染色质开放状态进而提高基因转录表达水平，AR ChIP-seq、H3K27ac ChIP-seq实验表明精胺能够在基因组水平显著下调AR与靶基因的结合及AR靶基因的H3K27ac修饰水平，相应地，ATAC-seq结果也显示精胺能够同时下调AR-FL、AR-V7信号通路基因的染色质开放状态。此外，在肿瘤细胞内敲减精胺氧化酶SMOX或过表达精胺合酶SMS使精胺在胞内累积，同样会下调AR信号通路基因的表达并抑制肿瘤细胞生长。 　　在对异常变化的代谢物的生物功能研究中，研究者发现代谢物通常会作用于细胞内不同的酶来调控基因表达和生长信号的传递，因此接下来团队探究了精胺是否作用于细胞内特定的靶点发挥其抗肿瘤作用。首先，基于药效团作用模型和配体结构相似性，通过靶标预测方法对其内源作用靶点进行预测，团队发现蛋白质精氨酸甲基转移酶（Protein arginine methyltransferases, PRMTs）可能是其潜在作用靶标。这也与前期研究报道PRMTs参与了前列腺肿瘤的发生发展相一致。PRMT1在前列腺肿瘤中的表达水平最高，进一步的同位素酶活实验及细胞内底物甲基化修饰检测实验均显示，在所有的PRMTs亚型中，精胺能够显著抑制PRMT1的酶活。一维核磁实验及分子对接实验进一步证明精胺可以直接结合PRMT1蛋白并占据其精氨酸底物口袋，为其对PRMT1的酶活抑制效应提供了结构基础。 　　在确证精胺与PRMT1的直接作用后，科研人员进一步探索精胺是否通过靶向PRMT1发挥抗肿瘤作用。对前列腺肿瘤组织芯片进行PRMT1免疫组化染色及TCGA数据库分析，发现PRMT1表达量随肿瘤恶性程度升高逐级增加，且与病人预后显著负相关，PRMT1基因表达水平与AR信号通路关键基因表达显著正相关。在肿瘤细胞中敲减PRMT1，细胞生长被显著抑制，AR-FL、AR-V7信号通路关键基因表达下调，敲减PRMT1后再进行精胺的处理，则精胺对AR信号通路的抑制效应被封阻。在CRPC移植瘤模型中，PRMT1敲减及精胺给药处理均能够显著抑制AR-FL、AR-V7信号通路及肿瘤生长，同样地，敲减PRMT1后再进行精胺给药处理，则精胺的抑制效应被封阻。至此，该研究进一步确证精胺通过靶向抑制PRMT1下调AR-FL、AR-V7信号通路从而抑制CRPC。 　　基于合作团队前期对蛋白质精氨酸甲基化酶的化学探针发现（J Med Chem. 2012;55:7978；J Med Chem. 2017;60:8888.;J Med Chem. 2017;60:6289）和针对肾细胞癌（Theranostics. 2021;11:5387）、肝癌（Theranostics. 2019;9:2606）的化学干预工作，团队运用自主开发的PRMT1的化学探针DCPT1061，同样能够在细胞和动物水平抑制CRPC。PRMT1的组蛋白底物H4R3me2a是一种经典的转录激活型修饰marker，H4R3me2a的ChIP-qPCR实验显示精胺与DCPT1061均能够显著下调AR基因启动子区的H4R3me2a修饰水平，进一步证明精胺通过抑制PRMT1酶活下调AR信号通路。DCPT1061与精胺均能够抑制AR与靶基因的结合并下调AR信号通路靶基因的H3K27ac水平，ATAC-seq实验也显示两者均能够抑制相关基因的染色质开放状态，且共同抑制的基因peaks数overlap在70%以上。因此，精胺作为PRMT1的内源性抑制小分子与PRMT1化学抑制剂发挥高度类似的生物功能，两者均能够抑制AR信号通路及肿瘤生长。 　　综上，该研究揭示了与前列腺肿瘤有高度临床相关性的代谢物精胺具有抗CRPC细胞增殖功能。表观修饰酶PRMT1是精胺的内源作用靶点，在前列腺肿瘤细胞中，精胺通过靶向PRMT1下调AR基因启动子区H4R3me2a修饰，抑制AR转录表达，并抑制AR靶基因与AR的结合、H3K27ac修饰以及AR-FL、AR-V7信号通路基因的染色质开放状态，从而下调AR-FL、AR-V7信号通路，抑制CRPC生长。精胺及PRMT1抑制在一定程度上克服了CRPC对AR抑制剂恩杂鲁胺等获得性耐药的局限。该研究提示，癌症进展过程中发生异常变化的生物活性分子或具有特定的生物功能，对其进行全面筛查分析其表观调控过程，探究这些异常变化的代谢物质是否会干预肿瘤进展，有助于深入探究肿瘤发生发展的内源生理机制，或可以为肿瘤的有效治疗提供更全面的干预手段。 　　上海药物所杭高院罗成工作室博士后李晓、分子细胞卓越中心博士后李飞和浙江理工大学叶飞教授为该论文的共同第一作者。上海药物所罗成研究员、张元元副研究员和中国科学院分子细胞卓越中心高栋研究员为该论文的共同通讯作者，该研究还得到上海药物所周虎研究员的支持，并获得国家重点研发计划、国家自然科学基金、杭州高等研究院研究基金等项目的资助。 　　全文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00809-4
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  • 《Cell Res | 上海药物所合作揭示多巴胺受体系统介导药物分子多重药理学活性的结构基础》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2023-05-24
    • 神经递质多巴胺（Dopamine）及其受体在人类中枢神经系统中扮演重要角色，它们参与调控诸如运动控制、认知功能、情绪调节和奖励机制等多种生理功能。异常的多巴胺信号传导与许多神经精神疾病关联，包括帕金森病、精神分裂症、抑郁症和成瘾等。药物分子的多重药理学（Polypharmacology）指的是一种药物可以同时作用于多个受体靶标的现象，某些不期望的靶向作用的发生往往伴随着毒副作用的产生。研究药物分子的多重药理特性一直是GPCR药理学领域的研究焦点和挑战。目前靶向多巴胺受体的抗帕金森病和精神分裂症等神经系统性疾病的药物多数存在多重药理学特性，然而关于其作用机理方面的研究匮乏，通过对多巴胺受体进行结构药理学研究，揭示药物分子多重药理活性产生以及药物分子对受体选择性的分子机制，有助于理解多巴胺受体系统激活，以及设计高效低副作用的多巴胺受体靶向药物。 　　多巴胺受体属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族，包含五个受体成员（D1R至D5R）。在过去十几年里，多个国际研究团队在多巴胺受体结构生物学方面取得了重大进展，这些进展极大地提高了学界对该系统机制的理解，并推动了针对多巴胺系统的药物开发。然而，D5R的结构以及激活态D4R的结构仍是该家族受体结构的空白，这在很大程度上限制了人们对多巴胺受体家族配体识别及激活机制的了解，成为了基于结构的靶向多巴胺受体药物研发的瓶颈。 　　2023年5月23日，中国科学院上海药物研究所徐华强研究员、北卡罗来纳大学教堂山分校Bryan Roth教授、浙江大学张岩教授、共同在Cell Research杂志上在线发表了他们最新的研究成果“Structural Genomics of the Human Dopamine Receptor System”，取得了多巴胺受体结构领域又一突破性进展。 　　研究团队采用单颗粒冷冻电镜技术，成功解析了五种多巴胺受体分别结合同一种激动剂分子罗替高汀（Rotigotine）以及下游G蛋白的复合物结构，分辨率分别为3.2 埃 (D1R–Gs)、3.0 埃 (D2R–Gi)、2.7 埃 (D3R–Gi), 3.2 埃 (D4R–Gi)以及 3.1 埃 (D5R–Gs)。该成果首次揭示了D5R以及激活态D4R的结构，并且系统地分析了整个多巴胺受体系统的多重药理学以及信号转导机制。 　　尽管五种多巴胺受体都通过结合相同的内源性配体多巴胺来发挥生理功能，但是，受体之间的细微结构差别不仅能够影响它们与药物分子的亲和力，也能激活截然不同的信号转导效应。为了揭示受体之间的结构差别，研究人员对五种受体的结构进行了对比，发现D1样和D2样受体之间存在较明显的区别。这些区别体现在受体胞外和胞内的几个区域：包括第一个跨膜螺旋（TM1）的N端区域、三个胞外环（ECL1-3）、第五跨膜螺旋（TM5）和第六跨膜螺旋（TM6）的胞内部分、和第二胞内环（ICL2）。 　　罗替高汀，一种用于治疗帕金森病和不宁腿综合症的药物，能够激活五种多巴胺受体，是具有多重药理学特性的典型药物分子。为了分析罗替高汀与不同多巴胺受体的结合基础，研究人员系统地对比了五种多巴胺受体与罗替高汀的结合模式，并通过药理学实验验证了配体与受体的相互作用。研究人员发现，多巴胺受体的配体结合口袋中下部分的氨基酸构成和结构相对保守，这部分被称为正构口袋（Orthosteric binding pocket, OBP），其结构在很大程度上决定了受体与配体的结合特性。然而，五种受体的配体结合口袋的中上部分存在较明显的差异，这部分被称为受体的延伸口袋（Extended binding pocket, EBP）。延伸口袋的结构非保守性使得罗替高汀在不同受体之间呈现构象差异，从而导致配体与受体亲和力的差异。 　　为了进一步研究不同受体的配体结合口袋与小分子多重药理学特性的关系，研究团队对罗替高汀进行了超过300种GPCR的结合活性筛选，发现罗替高汀不仅对多巴胺受体具有亲和力，还能结合其他多种GPCR，例如5-羟色胺受体（serotonin receptor）、肾上腺素受体（adrenergic receptors）、生长抑素受体（somatostatin receptors）、腺苷受体（adenosine receptors）和阿片受体（opioid receptors）等。通过结构和序列对比，研究人员发现配体的广谱结合能力与OBP的保守性有直接关联。 　　该研究还揭示了胆固醇对多巴胺受体功能的影响。研究团队发现，在D5R的第二胞内环附近的胆固醇分子稳定了色氨酸W3.52的构象，而D5R的近亲D1R在相同位点没有相应的胆固醇分子，这成为D1R别构调节剂具有高选择性的原因。同时，研究人员还发现在D4R的第一和第七个跨膜螺旋之间存在一个胆固醇分子，间接影响了配体与受体的结合。此外，研究团队还详细分析了多巴胺受体的激活机制以及结合下游信号蛋白的选择性机制。 　　总之，通过对多巴胺受体家族的系统性结构研究，该团队揭示了具有多重药理学特性的药物分子罗替高汀与五种多巴胺家族受体结合的结构基础，并拓展了学界对多巴胺受体配体识别基础、激活机制和信号转导机制方面的认识。 　　徐华强团队长期专注于多巴胺受体系统的结构药理学研究，并在近年来取得了一系列突破性成果。2021年2月，该团队在Cell杂志以封面论文形式发表了多巴胺受体D1R和D2R与G蛋白信号复合物结构的研究，率先揭示了多巴胺受体D1R与D2R的配体和G蛋白选择性机制 (Zhuang et al. Cell 2021)。2021年3月，该团队分别在Cell Research上发表了首个D1R与别构调节剂的复合物结构 (Zhuang et al. Cell Research. 2021)，以及在Molecular Cell上发表了首个激活态多巴胺D3R受体结构 (Xu et al. Mol Cell. 2021)。 　　在前期研究的基础上，这项成果不仅填补了多巴胺受体结构解析的空白，还在多重药理学研究领域取得了重要进展。这些系统性的多巴胺受体研究极大地丰富了研究人员对多巴胺系统结构与功能的认识，并为帕金森病、精神分裂症、抑郁症等疾病药物研发奠定了坚实基础。 　　上海药物所徐沛雨博士（现为MIT博后）、黄思婕博士（现为UCSF博后）、北卡罗来纳大学教堂山分校的Brian Krumm博士、上海药物所副研究员庄友文以及浙江大学医学院附属邵逸夫医院研究员毛春友为本文的共同第一作者。上海药物所徐华强研究员、北卡罗来纳大学教堂山分校的Bryan Roth教授和浙江大学张岩教授为该项工作的共同通讯作者。该工作获得了包括科技部重点研发计划、上海市市级科技重大专项、中国科学院先导专项、国家自然科学基金委、中国科学院特别助理研究项目等基金的资助。 　　全文链接：https://doi.org/10.1038/s41422-023-00808-0 参考文献 1.Zhuang, Y. et al. Structural insights into the human D1 and D2 dopamine receptor signaling complexes. Cell 184, 931–942.e18 (2021). 2.Zhuang, Y. et al. Mechanism of dopamine binding and allosteric modulation of the human D1 dopamine receptor. Cell Res. 31, 593–596 (2021). 3.Xu, P. et al. Structures of the human dopamine D3 receptor-Gi complexes. Mol. Cell 81, 1147–1159.e4 (2021).
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