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《微生物所在PD-1糖基化修饰与抗体药物作用机制研究中取得进展》

  • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者： hujm
  • 发布时间：2020-10-20

  • 　近年来，以PD-1/PD-L1为靶点的单克隆抗体治疗在肿瘤免疫治疗中取得了重大进展。PD-1是一个高度糖基化的免疫分子，而肿瘤的发生发展常伴随糖基化修饰的异常，并且PD-1的N-糖基化位点在人群中存在一定多态性，因此，研究PD-1的糖基化修饰及其对抗体药物作用的影响，对于理解PD-1为靶点的抗体药物作用机制及指导药物开发具有重要意义。Camrelizumab是靶向PD-1的IgG4型人源化抗体，该抗体于2019年5月在中国获批上市，用于复发/难治性经典型霍奇金淋巴瘤及肝细胞癌等的治疗，并展示出良好的临床治疗效果。

    　　2020年10月16日，中国科学院微生物研究所高福院士团队与澳门大学健康科学学院邓初夏教授团队合作，在EMBO Reports杂志发表了题为“N-glycosylation of PD-1 promotes binding of camrelizumab”的研究成果。研究发现PD-1分子N-糖基化修饰呈现多态性，不同表达系统的PD-1的蛋白稳定性评价结果表明糖修饰对PD-1分子的稳定性具有重要影响。研究者分别对camrelizumab与不同表达系统的PD-1的亲和力进行测定，发现camrelizumab与原核表达的PD-1分子的亲和力比与昆虫或哺乳动物细胞制备的PD-1亲和力低约200倍。研究者推测这种亲和力的差异很可能是由于PD-1分子在三种表达系统中的糖基化修饰不同造成的。

    　　研究者进一步解析了camrelizumab-scFv/PD-1的复合物结构。结构分析发现camrelizumab的重链的三个CDR区均可以与PD-1结合，轻链的LCDR1和LCDR3参与PD-1的结合。Camrelizumab的轻链与PD-1的结合区对PD-L1的结合形成很强的空间位阻，可以有效的阻断PD-1与PD-L1的结合。更重要的是，结构分析显示PD-1的N58位点上的N-乙酰氨基葡萄糖和海藻糖残基直接参与camrelizumab的结合。结合实验表明， N58A突变后的PD-1以及用去糖基化酶PNGase消化后的哺乳动物细胞表达PD-1蛋白与camrelizumab的亲和力均显著降低。对PD-1/PD-L1作用的阻断效应是camrelizumab发挥T细胞活化和抗肿瘤作用的主要机制，而流式细胞分析发现，PD-1的N58位点突变后，camrelizumab阻断 PD-1与PD-L1结合效率显著下降。

    　　本研究阐明了治疗性抗体camrelizumab与PD-1相互作用的分子机制，深入分析了PD-1的N58位点的糖基化修饰对抗体结合及其阻断活性的影响，为深入理解抗体药物的作用机制及指导药物开发提供了重要参考。

  • 原文来源：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202051444 ;http://www.im.cas.cn/xwzx2018/kyjz/202010/t20201019_5718926.html
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相关报告

  • 《微生物所在IL-1β介导炎症的调控机制中取得进展》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2022-04-01
    • 炎症是机体对病原微生物、有害刺激物或物理伤害所产生的防御反应。适度的炎症有利于清除病原微生物和修复受损组织，但过度的炎症会导致进一步的组织受损甚至危害生命。炎症一般可分为炎症激活、炎症消退以及组织修复、稳态重构三个阶段，细胞因子、趋化因子等炎性介质在炎症的不同阶段发挥着不同的作用。IL-1β是典型的促炎细胞因子，其表达受到双信号的严格控制。起始信号可以诱导无生物活性pro-IL-1β的表达，激活信号则能够激活炎症小体，随后成熟的Caspase-1将 pro-IL-1β切割成有生物活性的IL-1β并分泌到细胞外发挥作用。 　　Cyclophilin A（CypA）是一种在各种组织中广泛存在的肽基脯氨酰顺反异构酶。该团队十多年来对CypA进行了系统性的研究，发现CypA参与流感病毒复制、抗病毒天然免疫及流感病毒继发的细菌共感染（Cellular Microbiology, 2009；Cell Reports, 2021）。而且，CypA能够通过调控RIG-I/MAVS/NF-κB（eLife，2017）信号通路和IL-6反式信号通路（FESAB J，2021）促进IL-1β等炎症因子的表达，但CypA在炎症的不同阶段发挥怎样的作用仍然未知。此次研究就CypA在炎症激活、炎症消退以及组织修复过程中的作用及其作用机制进行了深入探讨。 　　该研究利用野生型和CypA敲除小鼠构建了LPS诱导急性肺炎的模型，分析CypA在炎症不同阶段的作用。结果显示，CypA在炎症早期能够促进炎症，而在炎症后期却发挥了抑制炎症的作用，这与CypA调控的IL-1β的产生密切相关。在炎症激活阶段，CypA增强Smurf1介导的pro-IL-1β的K63连接泛素化，进而有利于IL-1β的成熟。而在炎症消退阶段，CypA增强Smurf1介导的pro-IL-1β的K48连接泛素化及蛋白酶体途径降解。成熟的IL-1β与其受体结合后激活NF-κB、c-Jun等转录因子，触发炎症级联反应。研究人员进一步构建了IL-1β诱导急性肺炎的小鼠模型，发现CypA能够增强IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的表达，加重肺组织损伤。同时，CypA抑制Cyld介导的ILK去K63连接泛素化，从而正调控IL-1β/ILK/AKT信号通路，促进肺上皮细胞间质化介导的肺纤维化修复。综上，CypA通过增强IL-1β的表达和成熟促进炎症的激活和肺损伤，随后通过增强IL-1β的降解和IL-1β诱导的上皮细胞间质化促进炎症的消退和肺组织修复。 该研究揭示了CypA在炎症不同阶段对IL-1β介导炎症的调控机制，有助于深入理解炎症反应的复杂且精细的调控过程，并为抗炎症药物研究及IL-1β相关的炎症和肿瘤等疾病的治疗提供了重要理论支撑。 　　以上研究发表在Cell Reports期刊上，题为“Delicate regulation of IL-1β-mediated inflammation by cyclophilin A”。中国科学院微生物研究所杨文贤博士为论文第一作者，孙蕾项目研究员、刘文军研究员为论文共同通讯作者。该研究得到中国科学院战略性先导科技专项（B类）、国家自然科学基金委等资助。 　　文章链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)00249-2
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  • 《南海海洋所在抗性基因介导海洋微生物天然产物结构多样化研究中取得进展》
    • 来源专题：生物育种
    • 编译者：姜丽华
    • 发布时间：2023-05-11
    • 近日，中国科学院南海海洋研究所研究员张长生团队在抗性基因介导海洋微生物天然产物结构多样化研究中取得进展。研究揭示了糖苷酶KijX水解海洋微生物天然产物Lobophorin（LOBs）中的糖基侧链，从而介导菌株对LOBs产生抗性的新机制，阐明了异源重组菌株中LOBs的结构多样化是内源基因和外源基因簇间相互作用的结果，为抗生素耐药性和结构多样化研究提供了新思路。相关研究成果以A Widespread Glycosidase Confers Lobophorin Resistance and Host-Dependent Structural Diversity为题发表于《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。  抗生素耐药问题正在引发全球健康危机，普遍认为耐药性的产生与抗生素的广泛使用息息相关。但越来越多的研究发现，即使在人迹罕至的冻土和洞穴中发现的微生物中也存在抗生素抗性基因，表明环境微生物作为抗性基因的储存库，可能是临床耐药菌株中抗性因子的起源。这也提出了一个关于抗生素与其抗性基因演化过程中“先有鸡还是先有蛋”的有趣问题：是抗生素的广泛使用催生了抗性基因的进化，还是抗性基因本已古老存在，只是因抗生素的使用而加速了其发现过程？无论如何，从环境微生物中鉴别新的抗生素抗性基因，理解其生态功能，可以为抗生素的临床耐药性提供潜在的可控措施和解决方案。  LOBs属于螺环乙酰乙酸内酯类抗生素，研究人员前期从海洋来源链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 01127中分离到LOBs A/B，解析了LOBs生物合成中负责糖基化（LobG1、LobG2和LobG3）、糖甲基化（LobS1）和C-32羟化（LobP1）等后修饰酶的功能（图1）。但在近期研究中发现一个特别的现象：与野生型菌株产物不同，异源重组菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560（含有lob基因簇）中产生了一系列C-9位带单糖且C-32位为羟甲基的LOBs，而意外的是，虽然LobP1体外反应确证其负责C-9位带三糖或双糖的LOBs的C-32位甲基羟化，但LobP1却不能催化C-9位带有单糖的LOBs发生羟化（图1）。那么，异源重组菌株中这些C-9位带单糖且C-32位为羟甲基的LOBs是如何产生？ 基于上述问题，通过文献调研和生物转化实验，研究人员在异源宿主中发现了一个糖苷酶KijX，可催化LOBs中C-9位多糖链的水解，但不能催化C-9位带单糖的LOBs发生糖基水解（图1）。在异源重组菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560中，LOBs的合成经历了LobG1（C-17糖基化）、LobG3（C-9位连续添加两个糖）和LobG2（C-9位的第三个糖）催化的糖基化，KijX催化的C-9位三糖（或双糖）产物脱糖，LobG3催化的C-9位重新糖基化（单糖）的复杂过程（图2）。通过外源基因簇lob和内源基因kijX之间相互作用，最终实现了LOBs的结构多样化。 进一步生物信息学分析发现，KijX的同源酶在细菌、真菌和古菌中广泛存在。研究查询到细菌来源KijX蛋白2323个，真核生物来源68个，古菌来源9个。体外酶学实验显示，在选取的56个不同来源的KijX同源蛋白（相似性28-91%）中51个有水解糖基的活性，部分同源蛋白的活性优于KijX。由于KijX同源蛋白广泛存在于放线菌门中，推测该酶可能为放线菌对抗环境中LOBs的一种抗性机制。活性评价实验显示C-9位带有单糖或无糖的LOBs对放线菌指示菌株没有抑制活性；C-9位带有三糖或双糖的LOBs能够抑制不含kijX及同源酶基因的放线菌的生长。导入kijX基因后，敏感菌株对LOBs产生抗性。相反，C-9位带有三糖或双糖的LOBs不能抑制含有kijX及同源基因的放线菌的生长，但敲除kijX及同源基因后，菌株对LOBs敏感（图3）。这些实验证实了kijX及其同源基因为LOBs的抗性基因。菌株间的拮抗实验显示同样的结果，表明菌株通过产生LOBs来抑制同一生境中其他微生物的生长以获得竞争优势，体现了环境微生物间的一种共进化关系（图3）。 为了进一步阐明这类特殊糖苷酶的作用机制，研究人员解析了AcvX（KijX同源蛋白）的晶体结构。与AlphaFold2预测的15个其他KijX同源蛋白结构比较显示，这类酶含有典型的GH113家族糖基水解酶的（β/α）8桶状结构，但与典型GH113家族水解酶相比，KijX及其同源酶与底物结合的口袋呈现出特征的带负电的凹槽，这个负电凹槽是该类酶特异性对LOBs产生水解作用的关键结构特征。研究进一步通过晶体叠加和点突变分析找到了该类蛋白可能的催化位点，并推测了其催化机制。  绝大多数KijX同源酶在该研究之前被注释为未知功能蛋白，含有kijX的微生物在环境中分布非常广泛，涵盖了沙漠、海洋和深洞，以及人体和动物的肠道微生物。与此相反，含有LOB生物合成基因簇的微生物大多数来自于海洋环境。由此推测某些抗生素的抗性基因本已古老存在，抗生素的广泛使用加速了其发现过程。kijX及其同源基因作为LOBs的抗性基因是巧合还是必然，是否其进化的目的是为抵抗环境中的LOBs均还未知，它们的原始生物学功能有待进一步研究。 相关研究工作得到国家重点研发计划项目、国家自然科学基金重大项目等的支持。
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