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《微生物所在PD-1糖基化修饰与抗体药物作用机制研究中取得进展》

  • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者： hujm
  • 发布时间：2020-10-20

  • 　近年来，以PD-1/PD-L1为靶点的单克隆抗体治疗在肿瘤免疫治疗中取得了重大进展。PD-1是一个高度糖基化的免疫分子，而肿瘤的发生发展常伴随糖基化修饰的异常，并且PD-1的N-糖基化位点在人群中存在一定多态性，因此，研究PD-1的糖基化修饰及其对抗体药物作用的影响，对于理解PD-1为靶点的抗体药物作用机制及指导药物开发具有重要意义。Camrelizumab是靶向PD-1的IgG4型人源化抗体，该抗体于2019年5月在中国获批上市，用于复发/难治性经典型霍奇金淋巴瘤及肝细胞癌等的治疗，并展示出良好的临床治疗效果。

    　　2020年10月16日，中国科学院微生物研究所高福院士团队与澳门大学健康科学学院邓初夏教授团队合作，在EMBO Reports杂志发表了题为“N-glycosylation of PD-1 promotes binding of camrelizumab”的研究成果。研究发现PD-1分子N-糖基化修饰呈现多态性，不同表达系统的PD-1的蛋白稳定性评价结果表明糖修饰对PD-1分子的稳定性具有重要影响。研究者分别对camrelizumab与不同表达系统的PD-1的亲和力进行测定，发现camrelizumab与原核表达的PD-1分子的亲和力比与昆虫或哺乳动物细胞制备的PD-1亲和力低约200倍。研究者推测这种亲和力的差异很可能是由于PD-1分子在三种表达系统中的糖基化修饰不同造成的。

    　　研究者进一步解析了camrelizumab-scFv/PD-1的复合物结构。结构分析发现camrelizumab的重链的三个CDR区均可以与PD-1结合，轻链的LCDR1和LCDR3参与PD-1的结合。Camrelizumab的轻链与PD-1的结合区对PD-L1的结合形成很强的空间位阻，可以有效的阻断PD-1与PD-L1的结合。更重要的是，结构分析显示PD-1的N58位点上的N-乙酰氨基葡萄糖和海藻糖残基直接参与camrelizumab的结合。结合实验表明， N58A突变后的PD-1以及用去糖基化酶PNGase消化后的哺乳动物细胞表达PD-1蛋白与camrelizumab的亲和力均显著降低。对PD-1/PD-L1作用的阻断效应是camrelizumab发挥T细胞活化和抗肿瘤作用的主要机制，而流式细胞分析发现，PD-1的N58位点突变后，camrelizumab阻断 PD-1与PD-L1结合效率显著下降。

    　　本研究阐明了治疗性抗体camrelizumab与PD-1相互作用的分子机制，深入分析了PD-1的N58位点的糖基化修饰对抗体结合及其阻断活性的影响，为深入理解抗体药物的作用机制及指导药物开发提供了重要参考。

  • 原文来源：https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202051444 ;http://www.im.cas.cn/xwzx2018/kyjz/202010/t20201019_5718926.html
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  • 《南海海洋所在抗性基因介导海洋微生物天然产物结构多样化研究中取得进展》
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    • 编译者：姜丽华
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    • 近日，中国科学院南海海洋研究所研究员张长生团队在抗性基因介导海洋微生物天然产物结构多样化研究中取得进展。研究揭示了糖苷酶KijX水解海洋微生物天然产物Lobophorin（LOBs）中的糖基侧链，从而介导菌株对LOBs产生抗性的新机制，阐明了异源重组菌株中LOBs的结构多样化是内源基因和外源基因簇间相互作用的结果，为抗生素耐药性和结构多样化研究提供了新思路。相关研究成果以A Widespread Glycosidase Confers Lobophorin Resistance and Host-Dependent Structural Diversity为题发表于《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。  抗生素耐药问题正在引发全球健康危机，普遍认为耐药性的产生与抗生素的广泛使用息息相关。但越来越多的研究发现，即使在人迹罕至的冻土和洞穴中发现的微生物中也存在抗生素抗性基因，表明环境微生物作为抗性基因的储存库，可能是临床耐药菌株中抗性因子的起源。这也提出了一个关于抗生素与其抗性基因演化过程中“先有鸡还是先有蛋”的有趣问题：是抗生素的广泛使用催生了抗性基因的进化，还是抗性基因本已古老存在，只是因抗生素的使用而加速了其发现过程？无论如何，从环境微生物中鉴别新的抗生素抗性基因，理解其生态功能，可以为抗生素的临床耐药性提供潜在的可控措施和解决方案。  LOBs属于螺环乙酰乙酸内酯类抗生素，研究人员前期从海洋来源链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 01127中分离到LOBs A/B，解析了LOBs生物合成中负责糖基化（LobG1、LobG2和LobG3）、糖甲基化（LobS1）和C-32羟化（LobP1）等后修饰酶的功能（图1）。但在近期研究中发现一个特别的现象：与野生型菌株产物不同，异源重组菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560（含有lob基因簇）中产生了一系列C-9位带单糖且C-32位为羟甲基的LOBs，而意外的是，虽然LobP1体外反应确证其负责C-9位带三糖或双糖的LOBs的C-32位甲基羟化，但LobP1却不能催化C-9位带有单糖的LOBs发生羟化（图1）。那么，异源重组菌株中这些C-9位带单糖且C-32位为羟甲基的LOBs是如何产生？ 基于上述问题，通过文献调研和生物转化实验，研究人员在异源宿主中发现了一个糖苷酶KijX，可催化LOBs中C-9位多糖链的水解，但不能催化C-9位带单糖的LOBs发生糖基水解（图1）。在异源重组菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560中，LOBs的合成经历了LobG1（C-17糖基化）、LobG3（C-9位连续添加两个糖）和LobG2（C-9位的第三个糖）催化的糖基化，KijX催化的C-9位三糖（或双糖）产物脱糖，LobG3催化的C-9位重新糖基化（单糖）的复杂过程（图2）。通过外源基因簇lob和内源基因kijX之间相互作用，最终实现了LOBs的结构多样化。 进一步生物信息学分析发现，KijX的同源酶在细菌、真菌和古菌中广泛存在。研究查询到细菌来源KijX蛋白2323个，真核生物来源68个，古菌来源9个。体外酶学实验显示，在选取的56个不同来源的KijX同源蛋白（相似性28-91%）中51个有水解糖基的活性，部分同源蛋白的活性优于KijX。由于KijX同源蛋白广泛存在于放线菌门中，推测该酶可能为放线菌对抗环境中LOBs的一种抗性机制。活性评价实验显示C-9位带有单糖或无糖的LOBs对放线菌指示菌株没有抑制活性；C-9位带有三糖或双糖的LOBs能够抑制不含kijX及同源酶基因的放线菌的生长。导入kijX基因后，敏感菌株对LOBs产生抗性。相反，C-9位带有三糖或双糖的LOBs不能抑制含有kijX及同源基因的放线菌的生长，但敲除kijX及同源基因后，菌株对LOBs敏感（图3）。这些实验证实了kijX及其同源基因为LOBs的抗性基因。菌株间的拮抗实验显示同样的结果，表明菌株通过产生LOBs来抑制同一生境中其他微生物的生长以获得竞争优势，体现了环境微生物间的一种共进化关系（图3）。 为了进一步阐明这类特殊糖苷酶的作用机制，研究人员解析了AcvX（KijX同源蛋白）的晶体结构。与AlphaFold2预测的15个其他KijX同源蛋白结构比较显示，这类酶含有典型的GH113家族糖基水解酶的（β/α）8桶状结构，但与典型GH113家族水解酶相比，KijX及其同源酶与底物结合的口袋呈现出特征的带负电的凹槽，这个负电凹槽是该类酶特异性对LOBs产生水解作用的关键结构特征。研究进一步通过晶体叠加和点突变分析找到了该类蛋白可能的催化位点，并推测了其催化机制。  绝大多数KijX同源酶在该研究之前被注释为未知功能蛋白，含有kijX的微生物在环境中分布非常广泛，涵盖了沙漠、海洋和深洞，以及人体和动物的肠道微生物。与此相反，含有LOB生物合成基因簇的微生物大多数来自于海洋环境。由此推测某些抗生素的抗性基因本已古老存在，抗生素的广泛使用加速了其发现过程。kijX及其同源基因作为LOBs的抗性基因是巧合还是必然，是否其进化的目的是为抵抗环境中的LOBs均还未知，它们的原始生物学功能有待进一步研究。 相关研究工作得到国家重点研发计划项目、国家自然科学基金重大项目等的支持。
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  • 《Angew封面 | 上海药物所在蛋白核心岩藻糖基化位点解析方面取得进展》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心—领域情报网
    • 编译者：hujm
    • 发布时间：2023-07-27
    • 　蛋白糖基化是蛋白翻译后修饰之中最为复杂的一类修饰，在药物研发和新的药物靶点发现中有着十分重要的应用前景。核心岩藻糖基化，即α1,6-岩藻糖与N-聚糖最内部的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的连接。许多膜蛋白的核心岩藻糖基化与肿瘤生长、侵袭、转移和免疫逃避密切相关，抗体的核心岩藻糖基化会影响抗体的ADCC效应。近年来，核心岩藻糖基化在肿瘤的发生和新治疗靶标的发现中吸引了越来越多的关注。然而，目前核心岩藻糖修饰的研究工具十分有限。 　　针对上述难题，中国科学院上海药物研究所文留青课题组与周虎课题组合作开发了一种“可逆无痕”的标记策略，实现了对细胞表面核心岩藻糖基化的精准解析。相关研究工作于2022年10月12日以A Sensitive and Reversible Labeling Strategy Enables Global Mapping of the Core-Fucosylated Glycoproteome on Cell Surfaces为题在线发表于Angew. Chem. Int. Ed.杂志，并被选为当期封面。 　　团队首先设计合成了生物素化探针分子3。研究发现，生物素化探针分子3仍然可以被突变型的糖苷内切酶EndoF3（可以特异识别核心岩藻糖结构）所识别。更重要的是，在检测核心岩藻糖结构时，生物素化探针分子3比传统的叠氮化探针分子2有着更好的灵敏度，比传统凝集素检测核心岩藻糖的方法灵敏度高50倍左右。团队进一步研究发现，生物素化探针分子3（具有很大的修饰的基团）标记的糖肽，在通过链霉亲和素富集之后，仍然可以被野生型的糖苷内切酶EndoF3切割，实现无痕释放。所释放的肽段可以被质谱捕获，从而实现核心岩藻糖基化位点的精准解析。 　　团队应用该策略系统地分析了两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231 and MCF7（高侵袭和低侵袭的癌症类型）核心岩藻糖基化蛋白的组学。科研人员在两种细胞系中都发现了大量与细胞迁移、细胞粘附和基质组织相关的糖蛋白，支持了先前的发现，即核心岩藻糖基化通过调节许多重要的细胞膜相关蛋白的功能进而促进肿瘤生长、侵袭和转移。进一步研究发现，在高侵袭的乳腺癌细胞模型中，核心岩藻糖基化的蛋白种类和位点数目有着明显的提高。而在高侵袭的乳腺癌细胞中，某些关键蛋白的特殊位点出现了核心岩藻糖基化。这暗示了这些新发位点可能与乳腺癌的侵袭迁移相关。该项工作将推动核心岩藻糖基化在各种生物学和病理过程中作用机制的研究，同时也加速“无痕切割”策略在其他糖基化位点精准解析中的应用。 　　上海药物所文留青课题组助理研究员田银平和周虎课题组博士研究生王宇秋为论文的共同第一作者。上海药物所文留青研究员和周虎研究员为论文共同通讯作者。该项研究获得国家自然科学基金、临港实验室和上海市糖专项的资助。 　　全文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202206802
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