原标题：《CRISPR/Cas基因编辑技术及其在作物育种中的应用》
单位：中国农业科学院生物技术研究所
摘要：CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值，其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（DSBs），DSBs在通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式进行修复时，会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换，从而实现基因编辑。介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的作用机理及发展趋势，并对CRISPR/Cas技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结，以期为农作物育种提供有益的参考。
培育高产优质且抗逆性强的农作物品种一直是育种家追求的育种目标，而传统育种方法具有育种周期长、选育针对性差等缺点，难以实现快速育种的目标。CRISPR/Cas核酸酶技术是近年来发展起来的对基因组进行精准定点编辑的技术，具有操作简单、周期短、效率高等优点，利用该技术可以对基因组中的目的基因进行定向敲除、插入或定点突变，从而精确引入目标性状，为作物育种工作提供新的途径。
1、CRISPR/Cas基因编辑技术简介及发展
CRISPR/Cas基因编辑技术（genome editing）是植物基因功能研究和育种改良的热点技术，其由小分子RNA介导，且主要依赖于核酸内切酶在目标位置产生双链断裂（double strand breaks, DSBs），DSBs可以通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）两种方式进行修复，通过NHEJ的修复容易发生错误，使断裂位置产生小片段的缺失或插入，从而导致基因突变；在有供体DNA存在的情况下，有可能通过HDR进行断裂位置的修复，产生精准的基因插入或替换。
CRISPR-Cas系统包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种类型，其中Ⅰ型和Ⅲ型需要多种蛋白参与才能形成具有功能的Cas蛋白复合体，而来自于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型系统仅需要一种Cas蛋白就能够发挥作用。在Ⅱ型CRISPR-Cas系统中，入侵的外源核酸序列整合到前导序列与第一段重复序列之间，并转录成长链的CRISPR RNAs（crRNA）前体物，与反式激活tracrRNA（trans-activating crRNA）互补结合，然后在Cas9/RNAseⅢ加工下形成成熟的tracrRNA: crRNA复合物，通过crRNA与入侵DNA上原间隔序列互补配对，从而激活并诱导Cas9蛋白到原间隔序列的区域进行剪切，该过程需要在靶标DNA上有一段保守的PAM（protospacer adjacent motif）序列。Cas9蛋白包括两个区域，其中HNH结构域切割与crRNA互补的DNA链，RuvC-like域则剪切非互补的DNA链，从而形成DSBs，降解入侵片段。科学家利用上述原理，通过将crRNA和tracrRNA序列相连构成一个嵌合的sgRNA（small guide RNA）分子，实现对靶标的识别，并利用Cas蛋白进行定点剪切形成DSBs，随后通过体内NHEJ或HDR方式进行修复。近来，新一代CRISPR基因编辑工具CRISPR/Cpf1、单碱基突变及无外源DNA污染编辑的出现，标志着CRISPR基因编辑技术又取得了突破性进展。
1.1新一代CRISPR基因编辑工具CRISPR/Cpf1
2015年，张锋团队首先发现了Ⅱ类CRISPR系统第5亚家族的成员Cpf1核酸内切酶，并证实了来自氨基酸球菌属（Acidaminococcus）、弗朗西斯氏菌属（Franisella novicida）和毛螺科菌属（Lachnospiraceae）的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1都具有RNA引导的DNA内切酶活性，且AsCpf1和LbCpf1用于动物的基因组编辑效率与CRISPR/Cas9系统相似，但其与Cas9相比却具有更多优势：①Cpf1蛋白因更小而更容易进入组织和细胞；②Cpf1同时具有DNA和RNA内切酶活性；③Cpf1的初级转录产物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的参与；④Cpf1识别位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，扩大了基因组编辑的靶点范围；⑤Cpf1的切割位点离PAM序列较远，便于对同一位点进行多轮基因编辑；⑥Cpf1剪切后形成黏性末端，让DNA插入更可控。目前CRISPR/Cpf1基因编辑系统已被用于水稻、拟南芥等物种的基因组编辑，朱健康团队\[4\]利用该技术对水稻中RLK和CYP81A家族的4个基因进行同时编辑，各位点的敲除效率达到40%~75%。近期，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴团队与华中农业大学赵云德团队合作，利用能够识别“TYCV”序列的LbCpf1(RR)和LbCpf1(RVR)变体，以水稻OsPDS和OsSBEIIb基因为靶标基因，LbCpf1(RR)编辑效率达51%左右，该研究扩展了CRISPR/Cpf1系统在植物基因组中的编辑范围。
1.2单碱基突变编辑
在农作物遗传改良方面，少部分可以通过完全破坏基因功能来获得育种材料，但更多的是需要置换单个或数个碱基来改变基因的功能，从而实现定向改良作物农艺性状的目的，而利用CRISPR/Cas9定点修饰主要是依赖于效率低下的同源重组机制。2016年，哈佛大学David Liu团队发现了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。单碱基编辑技术通过将Cas9切口酶(Cas9 nikase, Cas9n)或无核酸酶活性的Cas9（nuclease dead Cas9, dCas9）与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）形成融合蛋白，并通过sgRNA（单链向导RNA）将融合蛋白引导至靶位点，在不引起DNA双链断裂的情况下对靶位点附近的单个碱基进行由C/G到T/A的精确置换，目前该技术已在植物、动物以及人细胞中实现了高效的定点突变。朱健康团队利用单碱基编辑系统APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A），率先实现了对水稻氮转运蛋白家族NRT1.1B和DELLA家族SLR1的碱基替换，随后高彩霞团队通过改进，成功地将此系统运用到三大重要农作物小麦、水稻和玉米的性状改良上，为作物品种改良带来了新的途径。
1.3无外源DNA污染编辑
目前常用的CRISPR/Cas9基因编辑技术主要是通过基因枪或农杆菌侵染的方法将DNA表达框整合到植物基因组中，此种方法一般需通过后代分离才能获得无CRISPR/Cas9 DNA的突变体材料。DNA\|free基因组编辑技术的建立，大大降低了外源DNA的整合率，为CRISPR/Cas9技术用于农作物品种改良提供了新思路。DNA\|free基因组编辑是通过将CRISPR/Cas9蛋白与gRNA在体外组装成核糖蛋白体（RNP），实现无外源DNA的基因编辑体系，避免外源DNA整合到基因组中产生潜在风险，从而推动作物基因编辑育种的发展。此技术已经在拟南芥、烟草、生菜等模式植物和水稻、玉米、小麦等主要粮食作物中得到了成功应用。高彩霞团队以小麦为研究对象，对此方法步骤做了详细总结，为其广泛应用提供了有力的技术支持。最近，瑞典科学家利用RNP方法成功实现了马铃薯的DNA-free基因组编辑，编辑效率达9%~25%。
2、CRISPR-Cas技术在作物育种中的应用
自CRISPR/Cas9技术被用于进行基因定点编辑以来，被广泛应用于酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠、人类等多个物种中。2013年8月，《Nature Biotechnology》期刊上同时刊登了3篇关于CRSPR-Cas9技术介导植物基因组定点编辑的文章，预示着该技术在植物中的广泛应用和迅速发展。其中Nekrasov等利用CRISPR-Cas技术在本生烟（Nicotiana benthamiana）中实现了基因组的定点突变，突变效率约为2%；Li等利用CRSPR-Cas9分别对拟南芥和本生烟中的PDS基因进行定点编辑，在原生质体系统中，拟南芥AtPDS和本生烟NbPDS突变效率分别为5.6%和38%，而通过农杆菌浸染发现，在植物中AtPDS和NbPDS的突变效率相差不大（拟南芥为2.7%，本生烟为4.8%），表明突变效率与植物基因型、生理状态和转化方式密切相关。该研究还在原生质体中成功实现了对AtPDS3的两个不同位点和同时对两个基因（AtRACK1b和AtRACK1c）的编辑，为植物基因编辑打开了新的思路；高彩霞团队利用基因枪技术首次在水稻中对OsPDS和OsBADH2基因进行敲除，突变效率分别为9.4%和7.1%，并获得了T0代PDS基因敲除的水稻纯合突变植株。同时，朱健康团队也利用CRISPR-Cas9技术分别在拟南芥和水稻中进行基因定点突变，突变效率分别为26%和84%；瞿礼嘉团队通过对Cas9蛋白进行优化，使该系统在水稻中对OsCAO1和OsLAZY1基因的编辑效率分别高达83%和92%。CRISPR/Cas9技术在植物中，尤其是作物中的成功应用，为该技术在作物品种改良中的应用提供了有力的技术支持，随后大量相关研究相继开展。
2.1在粮食作物育种中的应用
水稻是世界上最为重要的粮食作物之一，并且水稻遗传转化更易操作，因此近年来利用CRISPR/Cas9技术开展与水稻产量、品质及抗性相关的研究被大量报道。产量方面，王加峰等利用CRISPR/Cas9技术对调控水稻产量千粒重的基因TGW6定点编辑，T0代材料中该基因突变频率约为90%，其中纯合缺失突变率高达51%，T1代纯合缺失突变体千粒重显著增加。Li等利用CRISPR/Cas9技术以中花11作为转化材料对Gn1a、DEP1、GS3及IPA1基因进行定点敲除，结果表明T0代材料中突变效率分别为42.5%、67.5%、57.5%、27.5%，T2代纯合缺失突变体中植株籽粒数目及长度增加，达到增产的效果；品质方面，中国水稻研究所和东北地理与农业生态研究所同时采用CRISPR/Cas9技术对控制水稻香味的BADH2基因进行敲除，结果表明突变体材料中香味物质显著增加，为香稻育种提供了丰富的理论指导，加快了香稻的育种进程。抗性方面，李家洋与高彩霞团队利用CRISPR/Cas9技术以NHEJ修复方式对水稻5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）进行编辑，实现了水稻内源EPSPS基因保守区域两个重要氨基酸的定点置换，在T0代获得具有草甘膦抗性的突变体材料。Wang等利用CRISPR/Cas9技术修饰稻瘟病侵染效应因子基因OSERF922，以提高水稻对稻瘟病的抗性。近期，Tang等与袁隆平团队利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻中与镉离子吸收和积累相关的基因，获得了抗镉毒害的水稻品种。此外，朱健康研究组利用新型腺嘌呤碱基编辑器ABE7-10对调节水稻株型的OsSPL14和SLR1进行单碱基编辑，A/T到G/C的替换效率分别为26%和12.5%，该研究推动了作物精准分子育种的发展。
玉米不仅是世界第一大粮食作物之一，也是饲料、化工和医用等的原料。朱金洁等经过摸索，搭建了玉米基因组高效定点突变的技术平台，并在玉米全基因组范围内筛选高度特异的sgRNA靶标序列，为玉米品种改良提供了强有力的技术支持。杜邦先锋公司利用CRISPR-Cas9技术，将自然存在的糯玉米性状直接引入具有优良性状的杂交种中，解决了糯玉米产量低的问题，同时避免了繁杂的回交育种工作，同年，该公司利用CRISPR-Cas9技术将一个玉米内源启动子GOS2精确插入到玉米中乙烯应答调控因子ARGOS8的5′端，获得耐旱材料。
小麦属于异源多倍体，基因组庞大，因此通过传统方法育种难度很大。Zhang等利用CRISPR/Cas9系统对小麦粒长和粒重调控基因TaGASR7和穗密度调控基因TaDEP1进行定点编辑，获得的TaGASR7纯合突变材料粒重显著增加，TaDEP1纯合突变材料明显变矮。高彩霞和唐定中团队利用CRISPR/Cas9技术，获得了同时敲除3个同源基因的突变体，该突变体对白粉病表现出有较强抗性。
2.2在经济作物育种中的应用
Cai等利用CRISPR/Cas9技术对大豆光周期开花途径关键基因GmFT2a进行了定向编辑，靶向大豆内源GmFT2a上的3个位点，T1代纯合突变体植株花期延迟。Wang等建立了适用于棉花遗传转化体系的CRISPR-Cas9系统，以棉花叶绿素合成相关基因GhCLA1为靶标设计3对sgRNA，各靶标位点的编辑效率高达到66.7%~100%，为推动棉花基因组编辑工作打下了坚实基础。Xu等利用CRISPR-Cas9技术对CLV3进行了基因编辑，使得番茄果实的心室数显著增加；Soyk等采用CRISPR/Cas9技术对番茄抗成花基因SP5G进行定向编辑，突变体材料番茄开花及成熟时间提前约2周，且产量显著增加。以上研究结果表明该技术在番茄重要农艺性状改良方面具有巨大的应用潜力。双孢菇(Agaricusbisporus)非常容易褐变，从而影响其品质。Waltz利用CRISPR/Cas9技术对双孢菇的1个多酚氧化酶基因PPO进行定向编辑，获得的突变体材料中多酚氧化酶的活性降低了30%，抗褐变能力大幅提高。
3、展望
传统育种需要投入大量的时间和精力，才能将相关基因的有益变异累积为最佳的品种，而通过CRISPR/Cas9技术能够直接且有目的进行优良性状选择。但CRISPR/Cas9系统目前还存在一些技术方面的问题，有待进一步改进和探讨：①以往报道的CRISPR/Cas9技术在应用过程中会出现一定程度的脱靶现象，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性，严重限制了该技术的应用。提高sgRNA序列特异性和使用合适的Cas蛋白等都能够有效降低甚至消除脱靶现象。此外，2017年Rauch等在细菌中发现了能够阻断CRISPR-Cas9活性的AcrllA4蛋白，该蛋白让CRISPR-Cas9在基因编辑一段时间后“关闭其活性”，防止在不必要的位点随意剪切造成的脱靶效应。在此基础上，Yang和Patel采用冷冻电子显微镜和人体细胞培养等方法进一步揭示了AcrIIA4主要是通过竞争Cas9蛋白上的DNA结合域发挥作用，这一发现为CRISPR/Cas9技术在育种中的广泛应用提供了强有力的支持和保障。②基因编辑范围有限。CRISPR系统中，DNA的精确剪切依赖于gRNA及PAM序列。目前的研究中，CRISPR/Cas9所识别的PAM位点包括经典的“NGG”和Cas9改变后的“NGA”和“NGCG”等。CRISPR/Cpf1系统的发现进一步拓宽了基因组编辑的范围，与CRISPR/Cas9不同，CRISPR/Cpf1的PAM序列主要位于“T/A”富集区，包括LbCpf1识别的“TTTV”及LbCpf1(RR)变体识别的“TYCV”。如何有效拓展CRISPR系统PAM位点范围，是该技术在育种中广泛应用的关键所在。③提高同源重组（HDR）效率。目前CRISPR技术在作物育种中的应用，主要集中于依赖HNEJ途径的基因敲除，如何通过HDR实现高效率的大片段插入或碱基替换仍是一个挑战。Charpentier等最近的研究中，通过将同源重组过程早期关键蛋白CtIP与Cas9蛋白融合，从而激活HDR途径，在人类细胞、鼠受精卵细胞中将编辑效率提高2倍以上。Aird等将供体DNA通过PCV共价键连接到Cas9/gRNA核糖核蛋白复合体上，增加DSB处供体DNA的浓度，从而提高Cas9介导的同源重组修复效率。利用HDR在靶位点插入目的基因，将是基因编辑育种的重要攻关内容之一。
总之，虽然目前基因编辑技术还存在很多不足，但其相对传统育种的优势显而易见，因此其具有广阔的发展和应用前景，相信在不久的将来，经过优化和改良的基因编辑技术将成为培育作物新品种的主要手段之一。
来源：《生物技术进展》2018年第8卷第3期
