1.测定COVID-19恢复期患者的免疫学表型
对COVID-19恢复期成年患者和2015-2018年收集的非暴露人群外周血单核细胞(PBMCs)和血清样本进行侧向层析、SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD) ELISA、流式细胞检测。结果显示所有患者IgG阳性，绝大多数患者IgM、IgA阳性；CD3+细胞轻度增加；CD19+细胞轻度减少，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD3-CD19-细胞或CD14+CD16-单核细胞与非暴露组无明显差异。同时非暴露组HCoV-OC43和HCoV-NL63RBD呈现不同程度的IgG阳性。
2.构建SARS-CoV-2表位库
根据预测的SARS-CoV-2抗原表位，作者构建了不同的表位库（megapool，MP）——排除了刺突蛋白抗原、能够捕获50%总反应、用于预测主要HLA-ⅡCD4+ T细胞表位的CD4_R MP；覆盖整个刺突蛋白抗原的MP_S；针对12个主要HLA-Ⅰ等位基因（ⅠA、ⅠB）的CD8 MP_A和CD8 MP_B。
3.分析特异性T细胞应答反应
使用CD4_R MP或MP_S刺激PMBCs，通过流式检测TCR依赖的激活诱导标志物（AIM）定性或定量分析CD4+ T细胞应答反应。结果显示所有患者CD4+T细胞对SARS-CoV-2刺突蛋白和非刺突蛋白均存在明显的异性反应，且平均约有50%的反应针对刺突蛋白表位；有趣的是，非暴露组同样检测到刺突蛋白和非刺突蛋白特异性CD4+T细胞，说明存在交叉免疫反应。为进一步评估SARS-CoV-2 特异性CD4+T细胞的功能和分化情况，作者检测了MP刺激后的细胞因子水平，发现IL-2 、IFN-γ分泌增加，几乎没有IL-4、IL-5、IL-13或IL-17α表达，说明特异性CD4+T细胞是有功能的，且以TH1型为主。
类似地，使用CD8 MP_A、CD8 MP_B刺激PBMCs,通过检测AIM和细胞内细胞因子染色（ICS）分析CD8+T应答反应。结果显示70%患者CD69+CD137+阳性，ICS检测到IFNγ+CD8+T细胞，且大多数共表达颗粒酶B，少部分表达TNF，而不表达IL-10，说明COVID-19患者存在SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞反应。
由于刺突蛋白是SARS中和抗体的主要靶标，且抗体依赖于CD4+T细胞的辅助发挥保护作用，于是作分析了CD4+T细胞与抗体之间的相关性。结果显示抗刺突蛋白RBD Ig和IgG与CD4+T细胞、CD4+T细胞与CD8+T细胞高度相关。
4.CD4+和CD8+T细胞SARS-CoV-2 ORF靶点的研究
作者设计了代表单一抗原的表位库用以进一步探究CD4+T细胞和CD8+T细胞靶向抗原。结果显示引起COVID-19患者特异性CD4+T细胞反应的主要有刺突蛋白（27%）、M蛋白（21%）和N蛋白（11%），nsp3, nsp4 and ORF8引起部分反应(大约各占5%)；在非暴露组，主要由刺突蛋白（23%）、nsp14 (25%)、nsp4 (15%) 和 nsp6 (14%)引起CD4+T反应。与CD4+T细胞反应不同，引起COVID-19患者CD8+T细胞反应的有刺突蛋白（~26%）、N（~12%）、M(22%)、NSP6(15%)、ORF8(10%)和ORF3a(7%)；未暴露组未显示明显的靶向抗原，提示冠状病毒CD8+T细胞交叉反应存在，但不如CD4+T细胞交叉反应广泛。
