《embC-embA基因间隔区突变对结核杆菌耐乙胺丁醇的影响研究》

  • 来源专题:结核病防治
  • 编译者: 李阳
  • 发布时间:2014-10-17
  • 结核杆菌对乙胺丁醇(EMB)耐药性的快速增加给结核病的诊断和治疗带来了威胁。基于此,来自上海肺科医院的7位研究人员合作分析了从中国东部地区搜集到的乙胺丁醇临床耐药菌株中embC-embA基因间隔区(IGR)突变在细菌EMB耐药性产生过程中发挥的作用,其相关成果于2014年9月2日发表在Antimicrobial Agents and Chemotherapy上。

    研究共搜集到767个结核杆菌临床菌株,采用MGIT 960系统和最小抑菌浓度(MIC)测试法分析了它们对EMB的药物易感性,并对这些菌株的embC-embA基因间隔区进行了测序。此外,研究还依据已报道的重组耻垢分枝杆菌基因检测结果对embC-embA基因间隔区突变的转录活性进行了检测,并采用凝胶迁移率变动分析法(GMSA)研究了IGR突变对IGR与EmbR基因(embAB基因的一个转录调节因子)结合的影响。

    相关系数分析结果显示embC-embA基因间隔区突变与EMB耐药性存在相关性,具体为存在IGR突变状况的临床菌株的embA和embB mRNA水平均明显升高,且细菌针对EMB的最小抑菌浓度(MICs)也相应地升高。此外,研究还发现当菌株转变为耻垢分枝杆菌菌株时,其IGR突变的转录活性更强;相较于野生型片段而言,发生突变的IGRs与EmbR基因的亲和力更强;若将基因间隔区突变作为一种额外的标志物,则分子药敏试验(DST)的灵敏度可从65.5%提升至73.5%。究其原因,是由于embC-embA IGR突变增强了EmbR基因与embAB基因启动子区域间的结合,进而提升了embAB基因的表达,从而促进了细菌对EMB耐药性的增加。

    综上所述,识别IGR的突变并将其作为EMB耐药性检测的一个标志物能够提高分子药敏试验的灵敏度。

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    • 来源专题:结核病防治
    • 编译者:李阳
    • 发布时间:2014-12-31
    • 该研究的主要内容可归纳为以下5个方面: 1. 评价了牛分枝杆菌对6种抗结核药物的敏感性; 2. 研究中采用了一种标准化方法和一种简化的二分刃天青微量滴定法(d-REMA); 3. 二分刃天青微量滴定法(d-REMA)与对照方法的检测结果具有良好的一致性; 4. 在embB基因中鉴定出了4种新的单核苷酸多态性; 5. 未发现embB基因表达谱与乙胺丁醇耐药结果之间存在关联关系。 现对该研究的主要内容作一简要介绍: 来自意大利国立卫生研究院的研究人员采用MiddleBrook 7H11琼脂培养法(金标准)以及一种简化的二分刃天青微量滴定法(d-REMA)评估了源自动物的吡嗪酰胺耐药性牛分枝杆菌分离株对5种抗结核药物的敏感性,其相关成果于2014年12月29日在线发表于国际传染病杂志上。 研究首先对53个牛分枝杆菌分离株进行分类并检测了它们对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卡那霉素及吡嗪酰胺的耐受性(其中吡嗪酰胺为对照组药物);然后基于已获得的耐受性检测结果,对所有分离株的pncA和embB基因进行PCR扩增和DNA测序,发现所有的牛分枝杆菌分离株分为21个间隔区寡核苷酸分型(Spoligotype)/ MIRU-VNTR基因分型,且用琼脂培养法和d-REMA法均检测出所有菌株对吡嗪酰胺耐药。pncA基因测序结果证实H57D突变引起耐药性的产生;接着研究人员采用基于琼脂的金标准法检测出所有菌株对除吡嗪酰胺之外的其它5种药物均敏感,而采用d-REMA法检测出41个菌株对5种药物均敏感,其余12个菌株对乙胺丁醇的耐药检测结果不明确。 此外,研究人员还观察了53个分离株embB基因突变状况,并从中鉴定出4种新的单核苷酸多态性,但采用基于琼脂的金标准法未发现embB基因表达谱与乙胺丁醇耐药结果之间存在关联关系。 综上所述,所有的牛分枝杆菌分离株对一些最常见的抗结核治疗药物均是敏感的;二分刃天青微量滴定法(d-REMA)与基于琼脂的金标准法的检测结果具有良好的一致性;在乙胺丁醇敏感株中发现了4种新型embB突变。
  • 《应用PCR-反向点杂交技术快速检测结核分枝杆菌耐药突变基因》

    • 来源专题:结核病防治
    • 编译者:李阳
    • 发布时间:2016-10-18
    • PCR-反向点杂交技术是一种将PCR技术的高敏感度、反向斑点杂交技术的高特异性和膜芯片技术的高通量3种优势有效结合起来的快速基因诊断手段,可同时检测4种一线抗结核药物5个常见耐药相关基因上13个位点的突变,简便快速,且可直接采用痰标本进行检测,8小时即可得出结果。基于此,来自江西省胸科医院的研究人员以该院肺结核住院患者痰标本为分析样本,借助PCR-反向点杂交技术对一线抗结核药物(异烟肼、利福平、链霉素及乙胺丁醇)5个常见耐药突变基因上的13个位点进行了检测,用于了解基因突变发生频率及分布特点,并以药敏试验为金标准进行比较,分析其敏感度、特异度、符合率、阳性预测值及阴性预测值等指标,旨在评价其在结核分枝杆菌快速耐药检测中的应用价值,其相关成果发表于《中国防痨杂志》2016年第38卷第8期。 研究共纳入经病原学或病理学证实或符合菌阴肺结核诊断标准的1071例肺结核住院患者(男723例、女348例),且均送检了痰液标本。采用PCR-反向点杂交技术对上述痰标本进行异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)及乙胺丁醇(E)耐药基因检测,并以基于痰培养(改良罗氏培养)阳性标本的比例法药敏试验检测结果为金标准来验证基因检测结果的可靠性,进而评价其检测效能。 PCR-反向点杂交检测结果显示,596例结核杆菌阳性(阳性率为55.65%),其中218例(36.58%)检出H、R、S、E耐药基因突变,分布于所测13个位点。此外,根据药物突变位点检出例次占该药物基因突变总检出例次的构成比,发现H、R、S、E最常见突变位点分别位于KatG的315M(82.53%,137/166)、rpoB的S531L(69.50%,98/141)、rpsl的43M(78.65%,70/89)以及embB的306M2(55.13%,43/78)和306M1(39.74%,31/78)。 此外,433例患者标本同时行结核杆菌培养,发现157例培养及PCR-反向点杂交检测均为阳性,其中药敏试验结果显示耐药者74例,H、R、S、E分别耐药45、59、37及19例。以培养及药敏试验结果为金标准,PCR-反向点杂交法对H、R、S、E的耐药检测经Kappa检验具有较好一致性(Kappa值分别为0.77、0.73、0.66、0.49),其中反向点杂交法的敏感度分别为88.89%(40/45)、79.66%(47/59)、67.57%(25/37)、63.16%(12/19);特异度分别为91.07%(102/112)、91.84%(90/98)、95.00%(114/120)、91.30%(126/138)。 综上所述,PCR-反向点杂交技术用于结核杆菌耐药基因检测具有快速、可靠的优点,对早期临床用药具有指导作用,但限于检测基因的不足,使得诊断敏感度不够高,因而后续还需纳入更多突变基因来开展相关的试验研究。