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《植物所开发出基因组组装质量评估和改进新方法》

  • 来源专题：生物育种
  • 编译者： 季雪婧

  •     近年来，随着测序技术和算法的开发，大量动植物基因组被陆续测序和组装，但基因组组装质量参差不齐，存在不同程度的组装错误，影响后续的相关研究。高质量的参考基因组对于基因的精准注释和功能研究以及比较基因组学和调控元件的挖掘等至关重要。目前已有一些基因组组装质量评估的方法，而多数方法仅提供概述性的评估值，未能针对特定区域设置特定碱基给出精准度的评估。中国科学院植物研究所焦远年研究组研究开发了新的不依赖参考基因组的组装质量评估工具CRAQ （Clipping information for Revealing Assembly Quality），可以在单碱基水平检测和评估基因组序列的精准度，并提供了相关纠错方案。CRAQ通过将原始测序序列比对到组装的基因组上，基于序列比对产生的有效剪切对齐（clipping alignment）信息，精准地检测基因组中存在的组装错误。结合SMS长读长测序片段和NGS短读长测序片段与基因组比对的特征，CRAQ可以识别基因组内小规模的区域组装错误（CREs）和大范围的结构组装错误（CSEs）。不同类别的错误数量经过统计和标准化处理后被转化为两个组装质量评估指标——R-AQI和S-AQI，以反映不同层面的基因组组装质量。此外，CRAQ能够将组装错误与基因组内的高杂合区域或单倍型差异区分开来，并在单碱基分辨率下指示低质量组装区域和潜在错误断点的位置。因此，CRAQ能够帮助研究人员识别基因组中存在的嵌合片段，并将这些片段准确地拆分，以利于结合光学图谱或构象捕获（Hi-C）技术进一步构建结构更加准确的参考基因组。10月17日，相关研究成果发表在《自然-通讯》（Nature Communications）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和中国科学院青年交叉团队项目等的支持。

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  • 《转基因植物新材料育种价值评估》
    • 来源专题：转基因生物新品种培育
    • 编译者：zhangyi8606
    • 发布时间：2020-10-11
    • 作者：姜奇彦 胡正 孙现军 张辉 （中国农业科学院作物科学研究所） 引言 当前，以转基因育种为代表的生物育种技术发展迅猛，正在推动常规育种全面升级，引领育种产业发生重大变革。从研发进展来看，从基因克隆到新品种培育就像一个金字塔，众多实验室开展了基因克隆、功能分析及优异基因挖掘的研究工作，组成了转基因育种的重要基石。优异基因的遗传转化、转基因材料的创制和目标性状的功能效率评价，作为转基因育种的一个重要阶段承上启下。之后优异的转基因材料从实验室走向田间，完成小、中、大规模的中间试验、环境释放、生产性试验阶段，经受住严格的安全性评价，包括食品安全和环境安全，然后才可以申报安全证书。走到这一阶段的材料可以说是凤毛麟角了。但随着我国转基因研究成果的不断涌现，取得生物安全证书后的转基因植物是否可以作为种质资源利用，进入育种程序，它们的育种利用价值如何，还需要深入评估，才可以不断缩小克隆的基因与育种利用之间的差距，加速转基因作物新品种培育的育种进程。 顾名思义，育种价值评估就是对转基因材料进行育种利用价值进行评估，具体包括功能基因知识产权分析，育种利用价值评估，以及转基因新材料保存及育种价值评估信息管理等几个方面。 功能基因知识产权分析 转基因新材料育种价值评估和知识产权分析有什么关系呢？在世界各国加快培育生物产业、抢占生物经济发展先机的激烈竞争中，知识产权成为占领生物技术制高点，圈占世界生物遗传资源的有力工具。据不完全统计，主要发达国家和国际生物技术公司在农业生物技术领域部署的专利、品种权等知识产权数量估计在30万件以上。与跨国种业巨头相比，国内研究机构在知识产权拥有量，特别是核心功能基因的专利数量与质量上还存在较大差距，很容易陷入跨国公司的知识产权陷阱，从粮种源头丧失保障国家粮食安全的能力。面对发达国家远谋深虑的知识产权布阵设防，必须对我国重要性状基因的知识产权进行科学系统的分析，通过掌握这些重要功能基因在全球知识产权保护的范围、重点及趋势，设计出我国转基因农作物新品种培育、转基因育种成果产业化的合理发展路径，才能有效突破发达国家的专利封锁与围剿，培育出具有自主知识产权的功能基因和生物新品种，这样的转基因新材料才具有更高的自主创新性和更大的育种利用价值。 知识产权的分析包括很多方面，如转基因技术，克隆的基因，甚至包括转基因过程中用到的一些载体、菌株、启动子等。主要通过专利广泛检索获取原始数据，然后进行数据处理、分析和解读，进行知识产权分析，最终为我国的转基因事件提出规避专利纠纷的建议策略。如日本烟草公司（Japan Tobacco INC）建立的农杆菌介导的小麦遗传转化新技术的转化效率高达40%，给小麦功能基因的研究带来了革命性的发展机遇。如果使用该技术，需要从日本烟草公司购买该项专利技术的使用权，并签订相关的规范性文件。而遗传转化过程中用到的载体如pCambia3301、菌株如LBA4404和ubiquitin启动子都是在生物学研究常用的，不受专利保护。采用具有独立自主知识产权的愈伤组织特异性表达的启动子CP代替35S/Ubi来启动选择性标记基因的表达，可以回避因Monsanto公司持有35S启动子而可能产生的专利权纠纷。 转基因植物新材料育种价值评估 转基因生物育种是一项系统科学工程，包含基因克隆、遗传转化、转基因材料创制、新品种培育、产业化推广应用等环节。例如在杜邦先锋种业公司，将转基因生物技术发展归纳为七个阶段（A到G），包含A（New ideas）、B（Evaluate genetic approaches）、C（Optimize gene construct）、D（Create commercial event）、E（Commercial event to regulatory）、F（Breeding and testing）、G（Sell product），其中将E具有育种利用价值的“最佳转化事件”定为最重要的阶段。在我国也在不断加强基因和育种材料的利用价值评估工作，目的是筛选具有重要应用前景的基因和材料，并快速应用于新品种研发。 转基因植物新材料的育种价值评估主要针对目标性状，如抗病虫、抗逆、高产、优质等等。首先明确目标性状的鉴定技术，制定或完善转基因植物目标性状鉴定技术规范或技术标准，利用这些规范或标准对转基因植物新材料的育种利用价值开展综合评估，最终筛选出有重大育种价值的基因和转基因作物育种新材料，应用于转基因生物育种。 对于重大育种价值基因针对不同性状，我国也有初步的判定标准。总体来讲，转基因或分子标记辅助育种研究结果表明重大育种价值基因应该对目标生物的重要经济性状具有显著改良效果，但对其他性状无不良影响。具体举例来讲，如抗棉铃虫性状，参考国家现有棉铃虫抗性标准，抗性达1级以上；如小麦各类抗病性状，抗性达1级以上；如植物抗逆性状，在半致死剂量逆境条件下，与对照相比，转基因作物存活率提高10%以上；在正常环境下，对作物生长发育没有显著负面影响；抗除草剂性状，抗草甘瞵EPSP合酶基因，可以耐受4倍生产上使用剂量的草甘膦，抗草甘瞵N-乙酰转移酶基因，可以耐受4倍生产上使用剂量的草甘膦；作物高产性状，通过转基因或分子标记辅助选择在作物中进行了基因功能验证，提高作物产量5%以上；作物品质性状，极显著改进外观品质，如籽粒外观、加工品质、食味、营养价值等性状，极显著改进度量品质，如纤维长度、强度、细度；作物蛋白质、淀粉、油分、油酸和不饱和脂肪酸、赖氨酸、含硫氨基酸等性状，性状值提高5%以上。养分高效性状，能明显提高养分的吸收或利用效率，与对照相比，在产量不变的前提下，能减少5%-10%氮、磷或钾肥的用量，或在同等施肥条件下，产量比对照提高5%以上；光能高效性状，能明显提高目标作物的光能吸收或利用效率，与对照相比，光能利用效率或抗光氧化能力提高5%以上，或生物量/产量比对照提高5%以上。 对于转基因育种新材料需要具备目标性状表现突出、重要经济性状表现稳定的特点。举例来讲，抗白叶枯病转基因水稻，抗白叶枯病效果达到高抗。鉴定标准参照国际水稻研究所9级分级标准。耐盐转基因水稻，耐盐效果达到中抗以上，鉴定标准参照国际水稻研究所制定的9级分级标准制定。高产转基因水稻，与受体对照品种比较，产量增加10%以上；与区试对照品种比较，产量增加5%以上。抗逆转基因小麦，抗旱性达到极强或强水平，鉴定方法参照2008年农业部颁布实施的“小麦抗旱性鉴定评价技术规范”（GB/T 21127—2007）。高产转基因玉米，东北春玉米区，与受体对照品种比较，产量增加8%以上，与区试对照品种比较，产量增加6%以上；黄淮海夏玉米区，与受体对照品种比较，产量增加5%以上，与区试对照品种比较，产量增加3%以上；西南山地玉米区：与受体对照品种比较，产量增加10%以上；与区试对照品种比较，产量增加5%以上。针对不同的作物，不同的性状，都有各自初步的判定标准。 转基因新材料保存及育种价值评估信息管理 完成了对自主创新的新基因或转基因新材料的目标性状的评价似乎就完成了转基因作物育种价值评估过程。但从长远来讲，这些新材料的保存及信息、材料的共享利用，对于转基因材料在作物育种中的安全、广泛应用也很重要。 我国已建立了国家农作物种质资源库和保存中心，长期保存各类农作物基因资源39万余份，建立了农作物基因资源信息系统和农作物基因资源共享平台。国家种质库未针对转基因材料建立专门的保存设施，尚无转基因材料保存的相关技术标准，在保存手段上相对单一，不能较好地满足转基因材料的保存需求；现有的基因资源信息系统也未制定基因和转基因材料的相关数据标准，转基因材料的信息尚未进入基因信息数据库中，基因和转基因材料的信息，尤其是育种价值评估信息的共享几乎是空白，严重影响了转基因材料的深入和持续利用。许多转基因新材料未纳入国家种质资源保存体系，导致转基因材料分散于各研究单位或专家手中，不利于转基因材料的长期保存和利用，也容易引起潜在的基因污染。因此，迫切需要在国家农作物种质资源库的基础上建立转基因材料的国家管理和保存体系，对转基因材料进行集中编目、接收、检测、保存和分发利用，并建立基因和转基因新材料的数据库，开发信息管理系统，实施跟踪管理，并实现新材料与信息的社会共享。对转基因作物育种价值评估的范畴也应该包括对转基因材料保存的安全性、基因和转基因信息数据库的完善度、信息及材料共享利用的可行性等进行评估，为转基因材料在作物育种中的安全、广泛应用提供重要的保障。 当然，随着各种类型的转基因新材料的不断涌现，转基因新材料在作物育种应用中各种新问题的出现，以及育种家对转基因新材料应用的各种新要求的提出等，对转基因植物育种价值评估的内容及标准也会不断完善和更新，确保转基因新材料在未来转基因生物育种中发挥更重要的作用。
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  • 《遗传发育所开发出可预测的精细下调目标基因蛋白表达的新方法》
    • 来源专题：生物育种
    • 编译者：季雪婧
    •     基因编辑技术在植物中的开发和应用，为分子设计育种带来了革命性的变化。基于基因编辑技术建立基因精细调控的方法对于精准设计育种至关重要。目前应用最广泛的基因表达调控方法如CRISPR-Cas、CRISPRi和RNAi等技术，只能实现对基因的完全敲除或将基因的表达抑制到不可预测的水平。利用CRISPR-Cas9技术对启动子区域进行编辑，可以在转录层面将基因的表达调控至不同的水平，并产生大量不可预测的数量性状变异。而这种方法将耗费大量精力用以筛选理想的突变体。因此，开发新的能够可预测地精细调控基因表达的方法可以拓展现有的基因表达调控工具箱，为作物遗传改良提供有力的技术支撑。   上游开放阅读框（upstream open reading frame，uORF）是真核生物mRNA上普遍存在的翻译调控元件，对基因主效开放阅读框（primary open reading frame，pORF）的翻译具有抑制作用。2018年，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组率先利用CRISPR-Cas9技术对uORF进行编辑，建立了精细上调内源基因翻译的方法，并利用该方法培育出维生素C含量显著提高的生菜种质（Zhang et al., Nat. Biotechnol., 2018；Si et al., Nat. Protoc., 2020）。2020年，高彩霞研究组将这一技术应用于草莓的遗传改良，获得了梯度糖分的系列草莓新种质（Xing et al., Genome Biol., 2020）。近日，高彩霞研究组基于既往研究，进一步开发出能够可预测地精细下调目标基因蛋白表达的新方法。   uORF的长度及uORF与pORF之间的距离等多种因素均影响uORF对pORF翻译的抑制能力。因此，研究设想可通过以下两种策略抑制目标基因的翻译：一是在目标基因的5’ 非翻译区（5' untranslated region, 5’ UTR）从头产生新的uORF；二是原位突变内源uORF的终止密码子以延伸其表达框长度。原生质体瞬时系统的结果表明，这两种策略可以有效地将pORF的翻译抑制到不同的水平，且对其mRNA的表达量几乎没有影响。此后，研究利用碱基编辑和引导编辑系统获得了含有新创制uORF或内源uORF被延伸的水稻突变体植株，通过对突变体植株的蛋白表达水平和表型进行检测，发现突变体中引入的uORF变体对目标蛋白表达和表型的影响与瞬时系统结果一致。   为了实现对目标基因的表达进行连续的梯度下调，本研究结合以上两种策略，分别在水稻的OsTCP19、OsTB1和OsDLT基因的5’ UTR区域设计了一系列具有不同抑制能力的uORFs，瞬时系统的结果表明pORF的翻译水平被梯度地抑制到了原始水平的2.5-84.9%，实现了对基因的梯度敲降。OsDLT基因编码GRAS蛋白家族成员，参与水稻油菜素内酯信号转导途径，调控水稻株高、分蘖数、种子大小等多个重要农艺性状。该研究以OsDLT基因为靶标，通过编辑OsDLT基因的5’ UTR，获得了一组具有不同叶夹角、株高和分蘖数的突变体，且突变体的表型变化趋势与瞬时系统预测结果一致。
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