《bioRxiv:详解我国科学家开发出针对SARS-CoV-2的CAR-M细胞免疫疗法》

  • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
  • 编译者: hujm
  • 发布时间:2020-08-06
  • 2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行,导致肺炎合并多器官疾病住院人数突然大幅增加,并导致全球超过30万人死亡。COVID-19由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起,它是一种基因组为RNA的有包膜的β冠状病毒。SARS-CoV-2感染可能是无症状的,也可能引起广泛的症状,从轻微的上呼吸道感染症状到危及生命的败血症。COVID-19的临床表现包括无症状携带者和以败血症和急性呼吸衰竭为特征的暴发性疾病。大约5%的COVID-19患者(包括20%的住院患者)出现严重症状,需要进行重症监护。超过75%的COVID-19住院患者需要补充氧气。COVID-19的病死率因年龄不同而有明显差异,从5~17岁患者每1000名人中0.3人死亡到85岁或以上患者每1000名人中304.9人死亡。在重症监护室住院的患者中,病死率可达到40%。

    目前还没有针对SARS-CoV-2的人类疫苗,但大约有120种候选疫苗正在研发中。在开发有效疫苗的过程中,必须克服一系列挑战,如技术障碍、大规模生产和监管的可行性、法律障碍、潜在的免疫持续时间、产生免疫力所需的疫苗剂量,以及抗体依赖性增强作用等。此外,还有另一个复杂的领域需要考虑:针对COVID-19的药物开发,特别是针对重症或晚期COVID-19患者。据报道,与常规护理相比,地塞米松(dexamethasone)治疗可降低需要补充氧气的患者的28天死亡率(21.6% vs 24.6%;年龄调整后的比率比,0.83 [95% CI,0.74~0.92]),瑞德西韦可将康复时间(出院或不需要补充氧气)从15天减少到11天。在之前的一项针对103例COVID-19患者的随机临床试验中,恢复期血浆并没有缩短康复时间。正在进行的临床试验在测试抗病毒剂、免疫调节剂和抗凝血剂;但是,没有推荐针对COVID-19的特定抗病毒治疗。

    嵌合抗原受体(CAR)是一种合成受体,可将T细胞的活性重新导向特定的靶点。CAR构建体包括以单链可变区片段(scFv)形式存在的抗原识别结构域或者胞外结构域中的结合受体/配体、提供支架和信号转导的跨膜结构域,以及来自T细胞受体(TCR)的胞内结构域和触发T细胞活化的共刺激分子。基于长期以来对利用巨噬细胞对抗肿瘤生长的兴趣,经过基因改造后表达CAR的人类巨噬细胞(CAR macrophage, CAR-M)已经被开发出来,并对它们的抗肿瘤潜力进行了表征。巨噬细胞是先天免疫系统的关键效应细胞,负责感知和应对微生物威胁,并促进组织修复。

    因此,科学家们推测CAR-M细胞可以用来对抗SARS-CoV-2。然而,人们已发现巨噬细胞高炎症反应和细胞因子释放综合征(CRS)的存在,因而提出了关于使用CAR-M细胞清除病毒的安全性的问题。巨噬细胞高炎症反应对宿主造成损害,特别是在严重感染(包括SARS-CoV-2)的情形下。细胞因子释放综合征也是与CAR-T细胞疗法相关的最重要的并发症。

    在一项新的研究中,来自中国第二军医大学和上海交通大学医学院的研究人员开发出一系列基于识别SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的CAR受体,并测试了它们诱导对SARS-CoV-2病毒颗粒的吞噬能力。有趣的是,这些作者报道了一种具有MER酪氨酸激酶(MERTK)胞内结构域的CAR,即CARMERTK,而且与其他CAR相比,它在基于表达抗原的细胞模型中并没有表现出明显的杀伤作用,但在体外在没有促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)分泌的情形下却表现出对SARS-CoV-2病毒颗粒的抗原特异性清除。相关研究结果于2020年7月27日在线发表在预印本服务器bioRxiv上,论文标题为“CAR Macrophages for SARS-CoV-2 Immunotherapy”。

    巨噬细胞能抵御感染、清除体内破损或异常的细胞,以其吞噬活性、抗原呈递能力和灵活的表型著称。肺实质中的先天免疫反应以骨髓源性单核细胞分化为巨噬细胞为特征,是肺部对抗入侵病原体的一线防御。一般来说,单核细胞/巨噬细胞能够显著地限制病毒的复制。在病毒感染过程中,单核细胞增强的促炎症信号分子水平和引发的抗病毒反应已被证实适用于流感病毒、疱疹病毒和寨卡病毒。此外,最近有研究表明,一些COVID-19患者具有增强的促炎巨噬细胞活性,从而导致炎症细胞因子和趋化因子的加速产生,并且多在预后不良的受试者中观察到。

    据这些作者所知,目前还没有研究出基于合成细胞的COVID-19免疫疗法。表达CAR的T细胞(CAR-T)已经被证明是治疗B细胞癌症患者的一种非常有效的方法。利用经过基因改造的巨噬细胞的力量开发针对实体瘤的新型治疗方法是非常有意义的,这是因为CAR-T细胞疗法常常受到T细胞无法穿透实体瘤和抑制性肿瘤微环境的阻碍。与之前的报告相一致的是,具有胞质免疫受体酪氨酸基激活基团(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)的CAR受体能够触发巨噬细胞特异性吞噬和杀死抗原表达细胞。在这些作者的数据中,这些表达CAR的巨噬细胞(CAR-M)也表现出对SARS-COV-2病毒颗粒的强大吞噬能力;然而,这种效果伴随着促炎细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌增加。在CAR-T细胞治疗中,经过基因改造的T细胞增殖通常伴随着高水平的细胞因子释放综合征,干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、IL-6、IL-8和IL-10的循环水平升高。最近的报道已表明,宿主来源的单核细胞/巨噬细胞和CAR-T细胞之间的相互作用在细胞因子释放综合征的病理生理学中起着重要作用。这是有意义的,这是因为类似的炎症细胞因子的血清水平增加与COVID-19的严重性和死亡有关。有趣的是,在经SARS-CoV-2病毒颗粒处理的CARγ和CARζ细胞中,IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ和IL-10的分泌明显升高,这提示这些CAR-M细胞可能不适合应用于重症或晚期COVID-19患者中。

    以前的研究已表明,人类免疫细胞,如THP-1细胞系(人单核细胞白血病细胞系),容易受到SARS-CoV感染。这些作者没有观察到任何证据表明他们的SARS-CoV-2假型病毒感染了THP-1细胞。此外,THP-1细胞对病毒颗粒的摄取率非常低,即使是表达与S蛋白结合的截短CAR,也是如此,这就表明THP-1细胞并非先天性地吞噬病毒颗粒。 值得注意的是,作为在之前的报告中被认为是不成功的受体,CARMERTK在这些作者用于实验的THP-1细胞中表达时,没有表现出对靶细胞的杀伤作用,但却表现出与CARγ和CARζ相似的病毒清除能力。这些数据进一步支持CARMERTK介导“免疫沉默”的病毒颗粒清除,但不会引起促炎反应。

    MERTK与TRYO3和AXL一起,属于受体酪氨酸激酶(RTK)的TAM家族。这些受体可以被由磷脂酰丝氨酸(PtdSer)组成的复合配体激活,该配体通过维生素K依赖的蛋白配体Gas6或蛋白S与RTK连接,在先天免疫细胞中发挥关键作用。Gas6具有结合所有这三种受体的能力,而蛋白S是MERTK和TYRO3的特异性配体。凋亡细胞、外泌体和细胞碎片是PtdSer组分的主要来源。在某些情况下,PtdSer组分也是由活细胞(包括T细胞)上暴露的PtdSer斑块提供的。TAM家族受体成员的激活一般会引起先天免疫细胞的抗炎反应、稳态反应,减少因摄取“自我”组分而引起的过度炎症和自身免疫反应。然而,之前的研究也提出,包膜病毒可能劫持TAM受体,通过一个被称为“凋亡模拟(apoptotic mimicry)”的PtdSer依赖性过程促进附着和感染,并作为有效的TAM激动剂起作用,从而抑制靶细胞中的I型IFN反应。

    在这项研究中,表达CARMERTK的THP-1细胞对病毒感染的抵抗力相对较强,并能诱导出明显的病毒清除。需要注意的是,这项研究中使用的是非常简单的感染模型,因此,所使用的测定方法无法测量众多可能干扰CAR-M细胞行为的生理和病理因素,如IgG或补体介导的免疫复合物。当然,表达这种合成受体的细胞可以经过进一步的改造和开发,以实现精确的控制。

    总之,这些数据揭示了基于CAR的合成方法适用于COVID-19治疗。除了CAR-M细胞直接清除病毒外,这些作者发现有证据表明,基于MERTK的CAR受体并没有诱导促炎细胞因子水平的进一步上调,从而提高了CAR-M细胞在重症COVID-19中作为强效治疗剂的可能性。

  • 原文来源:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.26.222208v1;http://ctxy.bioon.com/xy/article_pc.html?id=6759649
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    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2020-07-31
    • 由新型SARS-CoV-2引起的2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行已成为全球卫生危机。在全人类缺乏保护性免疫力的情况下,SARS-CoV-2表现出前所未有的人与人之间的传播能力。虽然目前有几种候选疫苗正在进行临床试验,但目前还没有商业化的COVID-19疫苗。 SARS-CoV-2与另外两种密切相关的高致病性病毒SARS-CoV和 MERS-CoV同属冠状病毒科β冠状病毒属。SARS-CoV-2有一个大小为30kb的正义、单链RNA基因组。它的核衣壳蛋白(N)和由膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)以及刺突蛋白(S)组成的外膜包覆着它的基因组。 与SARS-CoV一样,SARS-CoV-2的S蛋白通过受体结合结构域(RBD)与它们共同的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,介导病毒进入宿主细胞。在此之前,科学家们已经证实,SARS-CoV和MERS-CoV的RBD包含主要的构象依赖性中和表位,并能够在免疫动物中引起强效的中和抗体,因而是有希望的疫苗开发靶标。 人们迫切需要开发重现SARS-CoV-2感染的小动物模型。鉴于SARS-CoV-2不使用小鼠ACE2作为它的受体,野生型小鼠被认为不太容易感染SARS-CoV-2。已通过不同的策略开发出表达人ACE2的转基因小鼠。这样的小鼠之前已被用于研究SARS-CoV-2感染和发病机制,并评估针对COVID-19的应对策略。 在一项新的研究中,中国军事医学科学院微生物流行病研究所的孙世惠(Shihui Sun)、秦成峰(Cheng-Feng Qin)和周育森(Yusen Zhou, 已故)以及复旦大学病原微生物研究所的姜世勃(Shibo Jiang)等人开发出一种适应小鼠的SARS-CoV-2毒株,它能够在呼吸道中高效复制,并且在有免疫活性的野生型小鼠中引起间质性肺炎。此外,他们还在用这种SARS-CoV-2毒株进行挑战的小鼠模型中测试了一种新开发的重组亚单位候选疫苗的保护效果。相关研究结果于2020年7月30日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Adaptation of SARS-CoV-2 in BALB/c mice for testing vaccine efficacy”。 在这项新的研究中,这些研究人员并不采取对小鼠进行基因改造使之表达人ACE2的方法,相反,他们采取了一种新的策略:他们对在临床上观察到的一种SARS-CoV-2毒株进行改进,使之能够适应小鼠呼吸道。他们构建出的这种SARS-CoV-2突变株,称为MASCp6,它能够在年轻小鼠和老龄小鼠中复制,并且这两组小鼠在遭受鼻内MASCp6感染后均出现肺炎和炎症反应,这是在人类患者中观察到的临床特征。 这些研究人员说,与SARS-CoV-2相比,对MASCp6基因组的深度测序显示,这种病毒的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)发生突变可能是MASCp6能够进入小鼠ACE2阳性细胞的原因。 为了显示他们的新模型在测试候选疫苗中的实用性,这些研究人员用两剂重组亚单位候选疫苗免疫雌性小鼠,然后用MASCp6病毒感染它们。他们发现,与未接种疫苗的对照组小鼠相比,接种疫苗的小鼠的病毒载量较低,并且没有发现明显的临床症状。 这些研究人员开发的适应小鼠的SARS-CoV-2毒株以及相应的小鼠感染模型增加了研究SARS-CoV-2传播的动物模型数量。这一点很重要,这是因为当前还没有一种感染SARS-CoV-2的动物模型能够重现人类疾病的所有方面。 一种理想的COVID-19动物模型应该重现在COVID-19患者中观察到的病毒复制以及临床结果。在这项研究中,这些研究人员报告了SARS-CoV-2在BALB/c小鼠中的快速适应性,所产生的MASCp6毒株不仅在气管和肺部中高效复制,而且还引起间质性肺炎和炎症反应,从而重现了在COVID-19患者中观察到的许多临床特征。在接种MASCp6后,SARS-CoV-2主要在小鼠的呼吸道中复制,肺部中的病毒RNA在接种3天后达到高峰,然后在接种5天和7天后下降。这些结果与其他转基因小鼠或人源化小鼠模型相一致。 特别值得注意的是,与年轻小鼠相比,老龄小鼠在MASCp6接种后出现了更严重的肺部损伤,这反映了COVID-19的死亡率和病死率强烈偏向于老年人的事实。死亡率仅有Jiang等人在SARS-CoV-2感染的ACE2转基因小鼠中报道过(Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.05.027)。 在SARS-CoV和MERS-CoV研究中,人们已开发出基于小鼠适应性毒株的挑战模型。病毒在小鼠肺部的连续传代导致适应性突变,从而增加病毒感染力。MASCp6基因组与它的亲本株IME-BJ05相比,含有5个突变,这些突变分别导致ORF1ab、S和N基因的4个氨基酸残基变化。N501Y突变似乎使得病毒刺突蛋白和小鼠ACE2发生更有利的相互作用,使之能够附着和进入小鼠宿主细胞,从而导致小鼠的毒力表型增加。除N501Y外,其他三个氨基酸变化是否也调节病毒感染性还有待确定。进一步的反向遗传学研究将会解决这一问题,并还可能使得人们快速合成具有增强毒力的重组SARS-CoV-2。此外,免疫染色结果显示,肺部棒状细胞和AT2细胞是MASCp6的主要靶细胞,这与之前从动物模型和COVID-19患者中获得的研究结果一致。 与之前描述的ACE2转基因小鼠或人源化小鼠相比,这些研究人员开发出的基于MASCp6的挑战模型采用了具有免疫能力的野生型小鼠,并将它们直接应用于各种候选疫苗的疗效评估。对这些小鼠用重组亚单位候选疫苗(RBD-Fc)免疫,可诱导出高水平(高达1:320)的抗SARS-CoV-2中和抗体,几乎消除了在遭受MASCp6挑战后小鼠肺部的病毒RNA复制。疫苗接种小鼠的血清中和抗体滴度与保护性疗效之间的潜在相关性,凸显了这一方便、经济的动物模型的多功能性。 最近,在系统进化树上与人类最接近的非人灵长类动物也被用于重现SARS-CoV-2感染,而且几种候选疫苗已经在它们中得到验证,保护效果良好。仓鼠、雪貂和猫也容易感染SARS-CoV-2,SARS-CoV-2感染后的临床结果从无症状感染到严重的病理肺部病变不等。目前没有一种SARS-CoV-2感染的动物模型能重现人类疾病的所有方面。因此,不同动物模型的建立应会极大地拓展我们对SARS-CoV-2传播和发病机理的认识,加快开发COVID-19对应策略。
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    • 来源专题:生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2020-12-21
    • 近日,发表在国际杂志Proceedings of the National Academy of Sciences上题为“A facile method of mapping HIV-1 neutralizing epitopes using chemically masked cysteines and deep sequencing”和国际杂志Journal of Biological Chemistry上题为“Design of a highly thermotolerant, immunogenic SARS-CoV-2 spike fragment”的两篇研究报告中,来自印度科学理工学院等机构的科学家们通过研究开发出了能有效抵御SARS-CoV-2和HIV的新型有效的疫苗策略。此前研究人员报告了设计了一种耐热的COVID-19候选疫苗,以及一种快速的方法,该方法能识别被抗体所靶向作用的HIV包膜蛋白上的特殊区域,而这种抗体则能够帮助科学家们设计出有效的疫苗。 COVID-19候选疫苗包含有称之为受体结合结构域(RBD)的SARS-CoV-2的刺突蛋白的一部分,该区域能帮助病毒吸附到宿主细胞上,当研究人员在豚鼠模型体内进行测试时,他们发现,候选疫苗能够引起宿主产生强烈的免疫反应。令人惊讶的是,这种候选疫苗还能在37度的温度下保持稳定一个月,而冻干的候选疫苗也能够对高达100度的温度耐受;这或许就使得疫苗能够便于储存和运输,而不需要昂贵的冷链设备进行运输就能在偏远地区进行大规模的人群接种。大多数的疫苗需要在2-8度的环境中或更低的温度下储存以免会失去疫苗的作用效力。与诸如mRNA疫苗等新型疫苗类型相比,制作基于蛋白质的疫苗在印度能够很容易扩大规模,因为印度的疫苗制造商们已经制作了几十年类似的疫苗了。 目前研究人员正在研究的候选疫苗还与其它许多正在研发的COVID-19疫苗之间有一个区别,其仅会利用RBD的特定部位,即一串200个氨基酸的序列,而不是整个刺突蛋白。研究人员通过质粒将编码该部分的基因插入到了哺乳动物细胞中,随后细胞就会制造出RBD部分的拷贝,研究者发现,RBD的配方在豚鼠体内引发免疫反应方面与刺突蛋白一样优秀,而且其在高温下也稳定得多,完整的刺突蛋白在50度以上的温度下会很快失去活性。研究者Varadarajan说道,目前我们需要项目资助来将相关研究结果推向临床研究阶段,其中就包括对大鼠进行的安全性和毒理性研究,以及在人体测试之前进行的工艺开发和临床试验,这些研究或许会花费大约10亿卢比。 在第二项研究中,研究人员重点对HIV病毒进行了相关研究,研究人员旨在寻找确定能被中和性抗体所靶向作用的HIV包膜蛋白的关键部位,这些抗体能够阻断病毒进入细胞,而且能很好地对其标记从而被宿主机体其它免疫细胞所发现。基于这些区域的额疫苗或许就能够诱导宿主机体产生更好的免疫反应。为了绘制该区域的图谱,研究人员使用X射线晶体衍射学技术和低温电镜技术,但这些方法耗时、复杂且昂贵,因此研究人员就想寻找其它方法最终得出一种简便但有效的解决方案。 首先他们对病毒进行突变以便称之为半胱氨酸的氨基酸能够在包膜蛋白的几个地方出现,随后研究人员加入了一种化学标签粘附在半胱氨酸分子上,最后再利用中和性抗体来靶向作用病毒。如果这些抗体因为被半胱氨酸标签所阻断而无法与病毒上的关键位点结合的话,那么病毒就会存活并引起感染,通过对存活突变体病毒中的基因进行测序,研究人员就能够识别出这些位点。 最后研究者表示,这是一种快速弄清楚抗体结合位置的方法,其对于疫苗设计非常有用,同时还能够帮助检测不同人群机体中的血清样本如何对相同的候选疫苗或病毒产生反应,从原则上来讲,研究人员还能将这种方法进行修饰以适应于任何病毒,当然这就包括SARS-CoV-2。