研究人员已经开发出一种新技术，可以灵活地扩展基于crispr的分子诊断学，使用微流体芯片可以同时运行数千个测试。单片芯片的容量从每次在1000多个样本中检测一种单一类型的病毒到搜索160多种不同病毒的少量样本，包括COVID-19病毒。
这种被称为多路复用核酸评价的组合排列反应(CARMEN)的技术在病人样本上得到了验证，它可以提供当天的结果，并且有一天可能被用于广泛的公共卫生工作。
这项研究发表在《自然》杂志上，由第一作者谢里·阿克曼和卡梅隆·梅尔沃德共同领导，他们都是麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的博士后。布罗德研究所的核心成员、麻省理工学院生物工程系副教授保罗·布莱尼，以及布罗德研究所的成员、哈佛大学教授帕尔迪斯·萨贝提和霍华德·休斯医学研究所研究员是共同的高级作者。
萨贝提说:“目前的大流行只是强调，快速和敏感的工具对于诊断、监测和确定人群中的感染至关重要。”“对创新诊断方法的需求可以在社区中广泛应用，这是前所未有的迫切。”
“基于crispr的诊断是一个有吸引力的工具，因为它们具有可编程性、敏感性和易用性，”Myhrvold说。“现在,扩大这些诊断的方法,我们可以发掘自己潜力综合方法——例如,使临床医生能够看到如果窝藏多重感染患者,排除整个面板的疾病很快,或者测试大量的患者严重感染。”
小型化CRISPR诊断
建立一个测试平台使用这种能力,团队转向微流体,调整和改进技术发达Blainey的实验室,研究人员在2018年创建的橡胶片,比智能手机,成千上万的“microwells”——小隔间设计每一双nanoliter-sized滴。一滴血中含有样本中的病毒遗传物质，另一滴血中含有病毒检测试剂。
“微波芯片的制作就像邮票——它是橡胶浇在模具上，”阿克曼解释说。“我们可以很容易地复制并与合作者分享这项技术。”
芯片使用的检测方法是改编自CRISPR-based诊断夏洛克,于2017年首次描述和开发团队从Broad研究所的科学家,麻省理工学院麦戈文脑研究所,研究所医学工程与科学麻省理工学院和哈佛大学生物工程研究所。
为了使用CARMEN平台，研究人员首先从样本中提取病毒RNA并复制这种遗传物质，类似于目前用于疑似COVID-19病例的RT-qPCR诊断的准备过程。然后，研究人员在每个准备好的样品中加入一种独特的荧光染料，并将混合物分成微小的液滴。
另一方面，检测混合物中含有CRISPR蛋白Cas13，这是一种寻找特定病毒序列的引导RNA，以及报告结果的分子。这些混合物也有颜色编码，并被分离成液滴。
成千上万的液滴从样品和检测混合物，然后汇集在一起，并加载到芯片在一个单一的管道步骤。芯片中的每一微瓦能捕获两滴。当探测液滴在同一微球的一个样品液滴中找到它的目标——一个特定的病毒基因序列，一个信号就会产生并被荧光显微镜检测到。整个过程，从RNA提取到结果，需要不到8个小时。
“将这两种技术结合在一个平台上，为我们研究临床和流行病学问题提供了令人兴奋的新能力，”合著者Gowtham Thakku说，他是麻省理工学院(MIT)传染病和微生物组项目的研究生。
CARMEN在单个微流体芯片上实现了4500多个测试，该芯片可以使用现有的荧光编码以多种方式应用于患者样本。例如，单个芯片可以同时测试单个病毒的1048个样本，或者测试169个病毒的5个样本。通过增加更多的芯片，容量可以很容易地进一步扩大:“我们通常在一天内运行四五个芯片，”阿克曼说。
多路复用功能
为了展示该平台的多诊断能力，该团队开发了一种策略，可以快速测试几十个样本，用于169种人类相关病毒，这些病毒有10多个已公布的基因组序列。研究人员使用多种芯片对58名患者的样本进行了检测。他们还在患者样本上使用CARMEN来区分A型流感病毒的亚型和检测HIV的耐药性突变。
该团队还将SARS-CoV-2(导致COVID-19的病毒)和其他呼吸道病原体的检测混合物纳入其中，通过使用合成的病毒序列，展示了该检测方法如何能够快速适用于检测新出现的病毒。
“CARMEN在诊断测试中提供了令人印象深刻的吞吐量和灵活性，”合著者Catherine Freije说，她是Sabeti实验室的哈佛研究生。
研究人员报告称，该平台的敏感性可与之前发表的《神探夏洛克》(SHERLOCK)的检测结果相媲美，他们还在继续改进，并利用更多的临床样本对CARMEN进行验证。该团队表示，结合《自然》杂志上描述的来自患者样本的成功测试数据，这种方法可以很容易地在临床中转换。
Blainey说:“这种小型化的诊断方法具有资源效率高、易于实现的特点。”“新工具需要创造力和创新，随着化学和微流体技术的进步，我们对CARMEN的潜力充满热情，因为社区正在努力抗击COVID-19和未来的传染病威胁。”
