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《以PD-1/PD-L1信号通路为靶点的抑制剂的研究进展》

  • 来源专题：重大新药创制—研发动态
  • 编译者： 杜慧
  • 发布时间：2016-04-25

  • 程序性死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）及其配体（PD-L1,PD-L2）是CD28/B7超家族成员，广泛表达于各种组织，PD-1/PD-L1信号通路作为T细胞免疫反应的协同刺激信号通路，在适应性免疫中发挥重要作用。近年来，以PD-1/PD-L1信号通路为靶点的抑制剂引起广泛关注。

    单克隆抗体

    目前，两个单克隆抗体，nivolumab和pembrolizumab获批用于治疗转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌，其他药物正在临床试验阶段。

    多肽和模拟肽

    尽管单克隆抗体临床活性较好，但其具有严重的免疫相关不良反应。而多肽和模拟肽免疫阻断剂可以突破这一限制。AUNP-12，以PD-1免疫检查点为治疗靶点的多肽正在临床前研究阶段。研究显示，AUNP-12具有强大的抗肿瘤活性，但其药代动力学分布时间较短。

    单克隆抗体的研发极大地刺激了小分子药物的发展，相比于单克隆抗体，小分子药物具有方便口服、不良反应较少、更易渗入组织或肿瘤等优点。目前，仅有一个专利(WO 2015/034820 A1)报道了小分子药物。

    PD-1/PD-L1信号通路作为调节T细胞分化增殖的重要抑制信号通路，在维持自身免疫耐受、肿瘤的免疫逃逸、慢性传染病的发展中具有重要作用。毫无疑问，未来还会有更多的以PD-1/PD-L1信号通路为靶点的单克隆抗体药物获批，但对于多肽及小分子药物，未来还有很长一段路要走。

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    • 8月20日，国家医保局、人力资源社会保障部对外正式印发《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》的通知，正式公布了国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险常规准入部分的药品名单。此次医保目录调整，在调出药品方面，共调出150个品种。除了被国家药监部门撤销文号的药品外，总共调出了79个品种。第一批国家重点监控合理用药的药品目录经专家论证全部调出。在常规准入部分，共新增了148个品种，其中西药47个，中成药101个。同时，此次医保目录共确定了128个药品纳入拟谈判准入范围，包括109个西药和19个中成药。均为临床价值较高但价格相对较贵的独家产品，而前三批谈判成功药数量总和仅为56个。 在尚未敲定的新的谈判准入药品目录中，抗癌药PD-1/PD-L1能否入选国家医保目录，目前仍留下悬念，业界处于高度关注状态。按照国家医保局前期发布的《2019年国家医保目录调整工作方案》，9-10月将是发布谈判准入目录阶段。对于PD-1/PD-L1是否应该纳入医保目录，业界存在不小争议：如果纳入，可提高药物的可及性；但纳入后高价药可能会占用更多的医保资金，药物滥用也是疑虑之一。争议归争议，企业还是正在积极准备参加国家医保目录新一轮的谈判准入。 下文对国内PD-1/PD-L1抑制剂进行分析。 PD-1/PD-L1 PD-1全称是程序性死亡受体1，英文名字为programmeddeath1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。PD-L1全称为细胞程序性死亡-配体1，英文名为Programmedcelldeath1ligand1，也称为表面抗原分化簇274（CD274），当它与PD-1结合时，就会诱导T细胞凋亡、抑制T细胞的活化和增殖，从而降低人体免疫力，肿瘤细胞快速增长。貌似有点抽象哈，啥也不说，上图！ image.png 上图中左边的就是我们人体内的“卫士”T细胞，右边的就是让人闻风丧胆的肿瘤细胞。正常来说，T细胞会识别肿瘤细胞然后进行杀伤攻击，但是肿瘤细胞上的PD-L1蛋白会让这一机制中断。可以看到，T细胞上的PD-1蛋白会和肿瘤细胞上的PD-L1结合，从而提供抑制性信号，诱导T细胞凋亡、抑制T细胞的活化和增殖，以至于肿瘤细胞会肆无忌惮的快速增长。 PD-1/PD-L1抑制剂 PD-1/PD-L1抑制剂是用来阻止PD-1和PD-L1结合的免疫哨点单抗药物。 image.png PD-1抑制剂与PD-1蛋白结合，从而使得肿瘤细胞无法与T细胞结合，这样T细胞就重获新生，重新对肿瘤细胞进行杀伤攻击。同理，PD-L1抑制剂也会和PD-L1蛋白进行结合，让T细胞重新对肿瘤细胞进行杀伤攻击，抑制肿瘤细胞的增长。 PD-1/PD-L1抑制剂的优势 PD-1/PD-L1抑制治疗是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的新型免疫疗法。PD-1/PD-L1抑制剂的诞生，为肿瘤医学的进步带来了巨大的跨越：它实现了横跨多个癌种的突破性进展，部分晚期患者实现了长期生存，可以说在现代抗肿瘤的拉锯战中取得了惊人的成绩，医学研究者们甚至断定，免疫治疗将会是未来攻克癌症的主要方向。现对PD-1/PD-L1免疫疗法、传统化疗、小分子靶向治疗的优缺点进行比较。 据药智数据显示，截至2019年8月14日，全球在研PD-1/PD-L1抑制剂有39个，其中在国内进行注册申报的有20个，上市的有6个，分别是百时美施贵宝的纳武单抗注射液和纳武利尤单抗注射液、美国默沙东药厂推出的帕博利珠单抗注射液、信达生物制药（苏州）有限公司的信迪利单抗注射液、苏州盛迪亚生物医药有限公司的注射用卡瑞利珠单抗和苏州众合生物医药有限公司的特瑞普利单抗注射液。 国内上市的6个药品适应症批准情况如下：纳武单抗用于（1）患有不可切除或转移性黑色素瘤的患者，作为单一药物或与ipilimumab联合治疗，（2）有转移鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)用基于铂化疗或后有转移患者的治疗；帕博利珠单抗注射液用于：经一线治疗失败的不可切除或转移性黑色素瘤的治疗；纳武利尤单抗注射液用于：（1）治疗表皮生长因子受体（EGFR）基因突变阴性和渐变性淋巴瘤激酶（ALK）阴性，（2）既往接受过含铂方案化疗后疾病进展或不可耐受的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者；信迪利单抗注射液用于：至少经过二线系统化疗的复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤的治疗。注射用卡瑞利珠单抗用于：至少经过二线系统化疗的复发或难治性经典型霍奇金淋巴瘤患者的治疗；特瑞普利单抗注射液用于：治疗既往标准治疗失败后的局部进展或转移性黑色素瘤。 PD-1/PD-L1抑制剂价格对比 据悉，纳武利尤单抗注射液（欧狄沃）、帕博利珠单抗注射液（可瑞达）国、纳武单抗（OPDIVO）、信迪利单抗注射液（达伯舒）国内上市价格比起美国、欧洲和香港都要低很多。 image.png 笔者的话 近年来，药监局先后推出的MAH制度，生物类似药的申报指南、优先审评、医保改革等政策，加快了生物制品的注册申报。目前国内各大企业对PD-1/PD-L1抑制剂这块大饼都“虎视眈眈”，信达生物、中山康方生物、上海恒瑞等知名企业研发的产品都处于临床阶段，相信不久之后他们各自的产品会相继在国内外上市，而对于我们这些普通百姓而言，肿瘤的治疗又会多一些选择，人类的健康之路将会更加宽广！
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  • 《抑制肿瘤外泌体PD-L1的分泌或可成为重要抗癌靶点| MD Anderson最新报道》
    • 来源专题：生物安全知识资源中心 | 领域情报网
    • 编译者：hujm
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    • 肿瘤-微环境相互作用在肿瘤进展、转移和治疗抵抗中发挥重要作用，并且越来越多的证据表明，肿瘤细胞衍生的外泌体可以通过转移分子（例如microRNA、mRNA和蛋白质）来系统地调节或重编程肿瘤微环境。PD-L1是一种经典的免疫表面蛋白，通过与受体程序性细胞死亡-1（PD-1）结合，抑制T细胞的抗肿瘤功能，有效保护肿瘤免受免疫监视。据报道，外泌体含有某些类型的蛋白质，包括促进癌症转移的膜蛋白，例如EGFR和MET。作为膜结合蛋白，PD-L1是否存在于癌细胞衍生的外泌体中，是否在肿瘤进展中发挥作用仍然未知。 研究人员通过连续离心从具有PD-L1表达或PD-L1敲除（PD-L1 KO）的MDA-MB-231（231）人乳腺癌细胞和4T1小鼠乳腺肿瘤细胞的细胞培养上清液中分离外泌体。透射电镜显示这些外泌体通常是球形的，并且是膜包封的，尺寸为30-100 nm。在从表达PD-L1的人乳腺癌细胞（231-PD-L1）和小鼠乳腺癌细胞（4T1-PD-L1）的培养上清中分离的外泌体中检测到PD-L1；在231-PD-L1 KO或4T1-PD-L1KO细胞培养上清中提取的外泌体虽然具有相似水平的外泌体标志蛋白CD63和CD81，但检测不到PD-L1表达。值得注意的是，外泌体分泌抑制剂GW4869的处理减少了231细胞中外泌体的产生（如外泌体标志蛋白CD63和CD81的减少或外泌体蛋白总量的减少）以及外泌体中PD-L1的水平，但对细胞裂解物中的PD-L1表达没有影响。此外，体外结合测定显示PD-1-Fc蛋白同时下拉231-PD-L1衍生的外泌体中的PD-L1（exo-PD-L1）和CD81。231细胞的免疫荧光（IF）染色和人乳腺癌组织的免疫组织化学（IHC）双染色证明PD-L1和CD63在多泡体（MVB）中的共定位，这是释放前细胞内外泌体的前体形式。这些数据进一步支持体外和体内的外泌体中存在PD-L1。 为了评估exo-PD-L1的生物学功能，研究人员首先想知道的是它是否可以将PD-L1转移至具有低（MCF-7）或无PD-L1表达的其他细胞（BT549-PD-L1 KO）。他们检测到PD-L1从exo-PD-L1转移至MCF7或BT549-PD-L1 KO细胞。 PD-L1蛋白的获得不是PD-L1基因表达的结果，因为这些细胞中缺乏PD-L1 mRNA。他们还建立了231-PD-L1 EGFP细胞，并在视觉上证明了231-PD-L1 EGFP衍生的外泌体向BT549细胞转移PD-L1 EGFP。为了验证这是否也在体内发生，他们将小鼠4T1-PD-L1 KO细胞与来自4T1-PD-L1 Flag（EX-PD-L1 Flag）、4T1-PD-L1KO（EX-PD-L1 KO）的外泌体或PBS共注射进入BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫。5天后收获肿瘤。肿瘤组织切片的IF染色显示EX-PD-L1 Flag而不是EX-PD-L1 KO使得4T1-PD-L1 KO细胞呈PD-L1 Flag阳性。重要的是，流式细胞术分析的结果进一步揭示由外泌体转运的PD-L1位于靶细胞的表面上并且能够结合PD-1。这些结果表明外泌体能够将功能性PD-L1转移至其他细胞。 鉴于外泌体的PD-L1可以直接结合PD-1，他们接下来检查外泌体PD-L1是否影响T细胞功能。研究结果显示，exo-PD-L1显着抑制T细胞对BT549-PD-L1 KO细胞的杀伤作用。接下来，为了探索exo-PD-L1是否抑制CD3/CD28触发的T细胞激活信号通路，他们通过用植物血凝素（PHA）处理外周血单核细胞（PBMC）来诱导PD-1表达产生T细胞母细胞。结果表明exo-PD-L1以剂量依赖的方式显着抑制CD3/CD28诱导的T细胞的ERK磷酸化和NF-κB活化，以及PHA诱导的白细胞介素-2（IL-2）分泌，所有这些都是T细胞活化的指标。此外，来自其他癌细胞系的exo-PD-L1，如结肠（RKO）和肺（ HCC827）癌细胞在阻断T细胞活化中具有相似的功能。总之，这些数据支持外泌体PD-L1抑制T细胞活化。 接下来，为了评估exo-PD-L1在肿瘤微环境和体内肿瘤进展中的作用，他们测量了与EX-PD-L1 Flag、EX-PD-L1 KO或PBS共注射的4T1-PD-L1 KO细胞的肿瘤生长。与之前的报道一致，4T1-PD-L1 KO细胞中的PD-L1缺乏导致肿瘤显着消退；然而，EX-PD-L1 Flag而非EX-PD-L1 KO显着恢复了4T1-PD-L1 KO细胞的肿瘤生长。然后他们将4T1-PD-L1 KO细胞暴露于增加量的EX-PD-L1 Flag，结果显示EX-PD-L1 Flag以剂量依赖性方式促进肿瘤生长。此外，与EX-PD-L1 KO或PBS共注射相比，具有EX-PD-L1 Flag共注射的4T1-PD-L1 KO肿瘤表现出更少的颗粒酶B表达，表明肿瘤区域中细胞毒性T细胞活性降低。这些结果表明EX-PD-L1通过抑制T细胞颗粒酶B的分泌来保护和促进体内肿瘤生长。这些发现与上述体外研究一致，体内结果同样证明外泌体的PD-L1可与PD-1结合并抑制T细胞杀伤活性。 上述IHC染色的结果显示PD-L1和外泌体标记物CD63在人肿瘤组织样品中的MVB中的共定位，他们试图进一步确定它们的共定位是否与患者乳腺癌的发展阶段有关。对一组人乳腺癌组织芯片的分析表明，与疾病的较高阶段相关的PD-L1-CD63共定位水平较高，这与最近关于外泌体中PD-L1水平相关的报道一致。根据上述结果，他们假设生长的肿瘤继续将exo-PD-L1分泌到肿瘤微环境中使T细胞功能失活，这可能诱导免疫治疗抵抗。为了探索靶向外泌体分泌增强免疫疗法功效的可能性，他们在小鼠模型中用外泌体分泌抑制剂GW4869与PD-L1抗体组合治疗肿瘤。首先，结果显示GW4869抑制4T1小鼠乳腺癌细胞的外泌体分泌。GW4869对外泌体分泌的抑制抑制BALB/c小鼠中的4T1肿瘤生长，但体外和免疫缺陷裸鼠中4T1细胞生长不受抑制，表明GW4869治疗本身不抑制4T1肿瘤生长，但可能通过调节抗肿瘤免疫，包括抑制exo-PD-L1分泌。因此，如所预期的，GW4869治疗显着增强了4T1肿瘤生长抑制中的抗PD-L1治疗功效。此外，为了特异性抑制4T1细胞的外泌体分泌，他们构建了Tet-on诱导型Rab27a敲低4T1细胞系。与先前报道一致，通过Dox处理敲低Rab27a显着抑制外泌体分泌，并且结果进一步显示Rab27a的敲低显着抑制4T1肿瘤生长。与GW4869治疗相似，肿瘤细胞中Rab27a敲低对外泌体分泌的特异性抑制显着增强了抗PD-L1治疗功效。因此，肿瘤细胞中药理学抑制剂（GW4869）和遗传方法（Rab27a敲低）对外泌体分泌的抑制显着抑制4T1肿瘤生长并增强抗PD-L1治疗功效。值得一提的是，通过敲除Rab27a或抑制剂GW4869治疗与抗PD-L1抗体治疗相比，肿瘤抑制作用相对深远，表明肿瘤细胞中分泌的外泌体PD-L1的阻断显着促进抗肿瘤免疫。此外，两者的结合导致更强的肿瘤抑制。 此外，尽管已经证明外泌体将PD-L1从PD-L1阳性转运到PD-L1阴性乳腺癌细胞，并且exo-PD-L1与T细胞上的PD-1结合以抑制T细胞活化和杀伤活性，据报道人类骨髓APC也表达PD-L1并且对免疫疗法有重要贡献。因此，他们还测试了含有PD-L1的外泌体是否可以将PD-L1转运至骨髓APC。他们检测到PD-L1从exo-PD-L1转移至人单核细胞系THP1（巨噬细胞和DC的前体）。流式细胞术分析的结果进一步揭示外泌体可以在体外将PD-L1 EGFP转移至人巨噬细胞和PBMC中的DC。在体内，IF染色结果显示EX-PD-L1 Flag使肿瘤浸润的巨噬细胞PD-L1 Flag呈阳性；然而，他们没有观察到DC中的阳性染色。目前尚不清楚为什么体内外泌体对PD-L1向DC的转移效率与巨噬细胞相比较低。这可能是由于较少量的DC和/或一些未知机制降低了肿瘤微环境中的效率。然而，结果表明PD-L1可以通过肿瘤微环境中含有PD-L1的外泌体转移到多种细胞类型，包括肿瘤细胞、巨噬细胞和DC（至少在体外）。因此，外泌体似乎充当运输载体以将PD-L1递送到肿瘤微环境中的不同细胞类型中以调节免疫监视。尽管尚不清楚表达PD-L1的巨噬细胞或DC是否也可能分泌外泌体-PD-L1，但结果表明，Rab27a敲除肿瘤细胞中外泌体分泌的阻断可抑制4T1肿瘤生长，GW4869治疗有类似作用。总之，该研究表明，来自肿瘤细胞的外泌体PD-L1在调节肿瘤微环境的免疫监视中起重要作用。 总的来说，目前的研究结果表明PD-L1通过其在外泌体中的存在发挥被动保护作用，同时也在主动防御中起作用，并且含有PD-L1的外泌体减弱肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫。此外，结果表明，外泌体PD-L1分泌的阻断有助于抗肿瘤免疫，并且外泌体分泌抑制和抗PD-L1治疗的组合具有改善临床中抗肿瘤反应的潜力。
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