2017年11月14日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所娄继忠课题组关于CRISPR-Cas9系统中Cas9蛋白复合体结合靶DNA形成R-loop复合体的过程分子机制的最新研究成果，题为“The initiation, propagation and dynamics of CRISPR-SpyCas9 R-loop complex”。
CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌抵御外来基因入侵的后天适应性免疫系统，它通过来源于外源基因片段转录产生的非编码RNA的引导实施对外源基因的破坏。近年来，基于II型CRISPR系统发展起来的CRISPR-Cas9基因编辑系统，因其设计简单、特异性强、效率高等优点，已成为最有效的基因编辑工具，被广泛用于基础理论、基因诊断以及临床治疗等领域。然而，越来越多的研究发现，与其他基因编辑工具类似，CRISPR-Cas9也存在较为明显的脱靶效应。阐明造成脱靶效应的来源及分子机制，并对其进行改进，是CRISPR-Cas9相关研究的重点领域之一。
在本项研究中，娄继忠课题组综合利用生物化学、单分子荧光技术及计算生物学方法对酿脓链球菌Cas9 (Streptococcus pyogenes Cas9, SpyCas9) 蛋白复合体识别靶DNA，并形成R-loop复合体过程的分子机制进行了较为系统的研究。研究发现，Cas9-sgRNA复合体将靶DNA序列分成多个功能区域：PAM、linker、seed、middle以及tail区。这些区域在R-loop的稳定性上发挥着不同的功能，对碱基错配的敏感度也有比较大的差异。其中seed区对错配的敏感性最高，middle区则存在序列依赖性。Linker区与tail区有较高的错配容忍度，有趣的是tail的错配反而能够增加其对靶DNA的切割活性。单分子荧光实验发现，Cas9-sgRNA复合体与靶DNA在形成R-loop过程中，至少经历一个高度动态的中间构象状态。这一中间态的稳定性，对于Cas9蛋白的切割活性密切相关，当sgRNA与靶DNA的近PAM区有18bp长度配对时，该中间态具有最高的稳定性，使得Cas9蛋白具有最高的靶切割活性。
