摘要
近日，科学家采用尼罗红（Nile Red, NR）进行选择性荧光染色，提出了一种基于密度提取和过滤的快速筛选方法，用于分析环境样品中的塑料微粒。研究采用的这种染料可以吸附在塑料表面，并在蓝光照射时发出荧光。研究者只要使用橙色滤光片进行简单的摄影便能够检测荧光发射，然后用图像分析方法对荧光颗粒物进行识别和计数。完成基础工作后，研究人员再对放大的图像进行记录和平铺，以覆盖整个过滤区域，从而可以检测出降解为几微米的塑料颗粒。基于被识别颗粒的表面极性特征，尼罗红的溶剂致变色性质还提供了进行塑性分类的可能性。文章发表在《Nature》期刊上，详细介绍了这种染色方法的发展及其与红外（IR）显微镜相比的初步交叉验证。发现可以在海洋沉积物样品中检测和计数不同尺寸的塑料微粒，且此荧光染色方法能够鉴定出IR显微镜在过滤区域扫描出的相同颗粒。
背景介绍
宏观和微观尺度的塑料垃圾都是广泛存在的，并已在世界各地海洋环境中积累。由于紫外线辐射、氧化和机械力作用下，塑料物品分解成越来越小的微型塑料碎片，直径小于5mm。来自纺织品、面部清洁剂和许多其他产品的合成纤维类微细碎片也是塑料微粒的直接来源。这导致了广泛海洋栖息地不断积累不同大小、不同聚合物类型的微塑料。由于它们的大小，塑料微粒可以被广泛的生物体摄入，可能威胁到生态系统甚至人类健康。微生物对海洋生物和人类构成的风险已经得到了广泛认可，并被纳入国家和国际海洋保护战略、政策和立法中，如欧盟海洋战略框架指令。了解塑料浓度、时空变化、尺寸、聚合物分布和碎裂动力学是理解微塑料命运和影响的前提条件。要监测微型塑料的空间和时间趋势，我们需要开发出简单而符合成本效益的标准化方案，保证能够高效、准确地列举各种环境基质中的微塑料。
微塑料的检测方法
以往科学家已经描述了研究沉积物中微塑性的各种浮选和密度方法。通过添加盐溶液增加海水密度，微量塑料便会随之漂浮，从而使得它们可以分离、过滤和分析。水层研究可以使用密度分离或直接过滤方法进行样品回收。生物区域研究则需要将微量塑料与周围组织分离，之后可将其与水或泥沙试样进行相似的加工处理。这种方法导致许多过滤器中包含有多种材料，包括需要识别和计数的微量塑料碎片。对于较大的微量塑料（0.3-5mm），视觉分选是可接受的方法，也是识别微塑料最常用的方法之一，通常使用类型、形状、降解阶段和颜色作为标准，但仍需要专家的专业知识和判断，而这一过程相当耗时。除了视觉定量外，最近的研究已经应用化学和物理特性、振动光谱学或电子显微镜，以降低假阳性/阴性误识别的风险，从而确定聚合物类型和实现自动化过程。采用傅里叶变换红外（FTIR）和拉曼显微光谱学，目前已经可以识别几微米的聚合物微粒。最近有几篇采用自动化显微镜进行微生物识别的文章，可以减少一部分科研劳动，但这些技术不能直接用于监测，因为受到速度慢、成本高和光谱分辨率差的限制，使得通过微光谱处理较大样品组具有很大挑战性。
微塑料的光谱分析方法
操作红外显微镜需要技术专长，并且从其光谱中分辨单个颗粒是容易出错的，特别是对于20微米以下的细小颗粒，显微镜分辨率不可避免地包括了来自周围环境的光谱信号（即其它相邻颗粒或过滤器本身）。从海洋环境收集的聚合物可能已经受到紫外线诱导的光降解、热降解和生物降解影响，改变了原始的聚合物组成。另外，沿海和海洋环境中的细菌可快速占据塑料微粒，形成连续的塑性特异性细菌集合体。这些降解过程和生物膜的影响造成光谱变化和聚合物降解产物的参考光谱不足，将使光谱分析进一步复杂化。对于小颗粒而言，这个问题变得更加明显，其较大的表面/体积比使来自表面材料的信号更显著。因此，许多颗粒将成为无法识别的类型，因其难以与木质纤维素、几丁质等天然聚合物相区别。尽管有这些缺点，上述光谱方法仍是大多数微塑料颗粒研究的选择方法，目前也是唯一可用的方法。
要开展不同种类的时空研究必需符合新的监测要求，并解决微塑料增长带来的新研究问题，所以迫切需要建立更便宜、更快速、更易于应用的方法。荧光染色方法提供了一种简单而敏感的方法来突出生物和医学研究中的特定物体或结构。Andrady曾提出使用亲脂性荧光染料（如尼罗红（NR））对地表水样品中的微塑料进行染色，以便于在显微镜下观察，但这一观察结果尚未得到贯彻。NR是脂溶性荧光染料，可进行脂质原位染色，常用于评估动物细胞和微生物的脂质含量，如哺乳动物细胞、细菌、酵母和微藻。此外，NR是溶剂致变色材料，其荧光发射光谱取决于其环境的极性。这种特质可基于微塑料的疏水性对其进行分类，如聚烯烃、聚芳香族、极性材料（聚酯/尼龙）等，或者可提供一个有用的指标，基于环境氧化与生物淤积影响，通过表面性质的时空变化来评估停留时间。在这篇研究中，作者详细介绍了这种快速筛选微塑料沉积物样品的方法。
研究结果
研究团队测试了多种染料吸附塑料的能力，最终采用了尼罗红NR，因为它在吸附和荧光强度方面最有效。研究人员确定了最佳的染色浓度（1?1000μg·mL-1）和染色孵育时间（5分钟至66小时）。他们使用较高的染料浓度提高了被染色颗粒的荧光强度，而且增加了沃特曼滤光片的背景信号。 10μg/ mL的实验浓度能够在可见度、速度和背景信号之间取得了良好的平衡。荧光强度随孵育时间快速增加，并在30-60分钟后稳定，随后保持恒定至66小时。孵育时间超过30-60分钟会导致未吸附染料（其具有低水溶性）的聚合和过滤器的更强着色，特别是存在高浓度氯化锌（用于增加密度）的情况下。对于大多数研究，可以采用10μgmL-1 NR孵育30分钟进行染色。
研究人员试验了不同浓度的ZnCl 2，以确定使微塑料漂浮的最佳密度，同时确保绝大多数无机矿物颗粒和其他潜在干扰物质在离心过程中沉淀。发现1.37 g mL-1的密度具有良好效果，最大限度地回收塑料微粒，并尽量减少过多不必要颗粒物的干扰。该值接近于PVC和PET的密度（常见的海洋微塑料成分），而许多常见的塑料密度则远低于此值，因此只有极少数不寻常的塑料（例如含氟聚合物）或致密的复合材料可能会通过沉淀除去。蟹爪碎片显示出暗橙色/红色荧光，可能会在计数中产生假阳性误报，但因其含有碳酸钙而被高度矿化，且密度高于塑料，因此会沉淀在提取物之下。
研究结果表明，大于100微米的塑料颗粒产生荧光且可容易计数，其平均回收率为96.6％。对于那些回收率大于100％的样品，其原始沉积物中可能存在另外的微塑料。该研究对每个沉积物选择了三个对照样品进行确认。对照样品含有一些非常小的荧光“点”，而且平均每1g沉积物中约有2个更大的碎片。这表示对照样品中的微塑料、实验室器皿和溶液中可能存在一定程度的污染物。本次研究没有采取任何预防措施来避免这种污染，以后可采用蒸馏水（0.22μm）洗涤所有设备并在使用前通过0.22μm过滤器（Whatman硝酸纤维膜过滤器或PTFE注射过滤器）预过滤所有溶液。研究者使用润湿的木制小棒从样品中收集所有荧光片段，通过拉曼显微镜分析来自对照沉积物的一些小荧光“点”，以此给出了指示碳酸钙的强条带，但是荧光染色表明它们具有有机性和疏水性。这些最有可能是矿化几丁质的小片段，这可能会导致假阳性。在实际样品处理条件下，几丁质碎片不会漂浮，因此能够与微塑料分离，但在此方法中不引起严重问题。它们在粗砂中的回收率非常高（> 97％），但在细小淤泥中的回收率较低，仅为85-88％。这可能是由于微塑料的滞留和埋藏程度，在报告塑料微粒载量时应予以考虑。
（於维樱 编译）
