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《Cell | 开发低镁浓度下快速DNA解旋的高效Cas9工具》

  • 编译者： 李康音
  • 发布时间：2024-05-26

  • 2024年5月22日，加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna通讯在Cell发表题为Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9的文章，报道了将耐热嗜热脂肪芽孢杆菌Cas9（Geobacillus stearothermophilus Cas9, GeoCas9）转化为有效的基因组编辑器的成果，提供了高效DNA靶向和切割的机制基础。

    通过全面的结构和生物化学分析，研究人员揭示了楔形（wedge, WED）结构域在调节GeoCas9的基因组编辑能力中发挥的关键作用。冷冻电子显微镜（Cryo-EM）结构显示，工程iGeoCas9变体的WED结构域中的三个关键突变与DNA靶链和非靶链建立了新的相互作用。这些相互作用不仅增强了iGeoCas9与其DNA底物的结合亲和力，而且赋予了松弛的PAM（protospacer-adjacent motif）特异性，从而能够有效靶向更广泛的基因组序列。

    这项研究揭示了iGeoCas9加速DNA解旋的能力。这种增强的DNA动力学补偿了哺乳动物细胞典型的显著损害了野生型GeoCas9的活性的镁限制性环境。荧光报告基因分析显示，即使在低镁浓度下，iGeoCas9也能快速通过中后期限速步骤R环形成。研究人员通过将WED结构域突变引入另一种Cas9同源物Nme2Cas9，进一步证明了他们合理工程方法的可转移性。工程化的iNme2Cas9变体表现出显著的基因组编辑效率，优于先前报道的通过连续进化方法工程化的Nme2Cas9变体。值得注意的是，与野生型酶相比，iNme2Cas9的编辑活性提高了100倍，突显了WED结构域工程的变革潜力。

    总之，这项开创性的研究不仅阐明了iGeoCas9增强基因组编辑能力的结构和机制基础，还为CRISPR-Cas系统的合理工程制定了一般策略。通过关注WED结构域，一种以前未被重视的Cas9功能调节因子，研究人员揭示了一种开发更有效、更强大的基因组编辑器的简化方法。这一基本理解为开发下一代基于CRISPR的疗法铺平了道路。

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    • 来源专题：生物育种
    • 编译者：季雪婧
    •     基因组编辑技术是生命科学领域的颠覆性技术，为生物学基础研究和应用研究奠定了坚实的技术基础。历经十余年的不断迭代和迅猛发展，基因组编辑技术经历了两个阶段。第一阶段以CRISPR-Cas9技术为代表，利用序列特异性核酸酶良好的靶向性和可编程性，在基因组特定位置产生DNA双链断裂，继而通过细胞内源修复机制产生随机、不可控的小片段插入或删除，达到基因敲除的目的。第二阶段包括碱基编辑技术和引导编辑技术的开发与应用。碱基编辑技术能够在不依赖DNA双链断裂的情况下实现特定碱基的高效精准替换，而引导编辑更能够精准实现碱基的任意形式突变以及小片段DNA的精准插入或删除，提升了基因组编辑的精准性，拓宽了技术的应用范围。上述技术的叠加使得科学家能够高效、快速并准确地实现基因敲除、碱基定向突变及少量核苷酸的插入或删除等小片段DNA水平的精准操纵。随着生物领域研究的快速发展，小片段DNA的编辑已不能满足研究和应用的需要。新的需求正引领基因组编辑技术突破DNA操纵长度的限制，迈入第三阶段，即实现kb级大片段DNA甚至是染色体水平的精准编辑。然而，目前能够实现大片段DNA精准操纵的基因组编辑工具颇为有限，尤其在植物研究领域，相关工具未见报道。   近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组开发了PrimeRoot（Prime editing-mediated Recombination Of Opportune Targets）技术，通过系统整合优化的引导编辑工具和位点特异性重组酶系统，实现长达11.1 kb的大片段DNA的高效精准定点插入。研究通过结合该实验室开发的ePPE（Engineered Plant Prime Editor）以及David Liu实验室研发的epegRNA（Engineered pegRNA），在植物细胞内建立了dual-ePPE系统，实现了最高效率可达50%以上的短片段DNA的精准定点插入，继而使用荧光报告系统在水稻原生质体中评估了分属丝氨酸家族和酪氨酸家族的8种位点特异性重组酶的工作效率，最终将dual-ePPE与筛选出的高效的酪氨酸家族位点特异性重组酶Cre相结合，开发了能够实现大片段DNA精准插入的PrimeRoot系统。该系统在水稻和玉米中能够实现一步法大片段DNA的精准定点插入，效率可达6%，成功插入的片段长度最长达11.1kb。相比于传统非精准的非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）策略，PrimeRoot插入5kb及以上DNA片段的效率有明显提升，且插入完全精准可预测，在编辑效率和精准性上具有显著优势。   该工作展示了PrimeRoot介导的大片段DNA精准定点插入的两个具体应用场景：启动子的原位插入是基因功能研究以及新性状创制的重要途经，因而科研人员利用PrimeRoot在水稻HPPD基因的5‘UTR区精准插入了Actin启动子（1.4kb），实现了启动子序列在功能基因UTR区域的原位插入；外源功能基因的导入是赋予作物新性状的主要手段之一，而传统基于农杆菌的转基因方式插入位置随机且不精准，导致内源功能基因的破坏或外源插入基因表达水平不稳定，使得理想种质的筛选过程繁杂冗长，PrimeRoot大片段DNA精准定点插入为解决这一问题提供了全新方案。该研究通过生物信息学分析预测出水稻内33个可用于外源基因插入的基因组安全港（Genomic safe harbor，GSH）区域。全基因组测序分析表明，传统农杆菌介导的T-DNA插入是完全随机不精准的，且无33个GSH内的插入事件。相比之下，PrimeRoot介导的插入能够完全精准定点地落入指定的安全港区域且在全基因组范围内检测不到可预测的脱靶事件。在此基础上，该工作使用PrimeRoot将稻瘟病抗性基因pigmR精准插入到预测的GSH内实现了快速抗病育种。为了进一步提高PrimeRoot的效率，该研究在水稻中建立了PrimeRoot组分和插入DNA组分的连续转化体系。该体系下大片段DNA精准插入的效率相较于一次转化提高了2-4倍，插入Actin启动子（1.4kb）的效率达8.3%，插入pigmR基因表达框（4.9kb）的效率达6.3%。   综上，科研人员通过工程化结合引导编辑器与位点特异性重组酶，开发了能够在植物中实现10kb以上大片段DNA高效精准定点插入的PrimeRoot系统。该系统将为基于基因堆叠的植物分子育种和植物合成生物学研究提供有力的技术支撑。
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  • 《配料开发的未来》
    • 来源专题：食物与营养
    • 编译者：韩宇静
    • 发布时间：2019-04-17
    • 这是食品和饮料产品开发的激动人心的时刻。消费者更愿意尝试新的令人兴奋的食物和口味，这导致了创意产品的大量涌现。不过，与此同时，消费者对食品和饮料产品的需求变得越来越强烈，这意味着产品和配料制造商必须重新考虑他们如何制定产品和原料。因此，最少的加工、格外健康的原料以及创新口味的食品都有望在2019年的食品和饮料产品开发上做出成绩。 本月的"食材"专栏将介绍一些最新开发的食材，这些食材可以满足这些趋势以及更多的需求，同时也为市场研究人员提供了一些关于食品和饮料产品发展前景的见解。根据协同香味（Synergy Flavors） (Synergy 2018a, 2018b)的最新研究，柚子、糯米团、生日蛋糕、酸樱桃、提拉米苏和巴西莓等运动营养产品的口味趋势有望给运动营养市场带来惊喜。对于产品开发人员来说，了解哪些口味新兴或流行，是制定能够吸引消费者注意力的食品和饮料产品的关键信息。协同香味进行了广泛的研究，列出了在北美和拉丁美洲的运动营养市场中具有潜力的新兴、增长、主流和已确立的风味趋势。 协同香味首席研究员亚历山大·马苏（Alexandre Massumoto）说，北美和拉丁美洲市场正在影响世界各地的营养公司，而且这两个市场也有一些风味趋势正在影响世界其他地区的食品和饮料产品制造商。协同香味营养业务开发经理威尔·麦科马克（Will McCormack）表示，该公司进行这项研究的部分原因是，一些运动营养客户要求获得有关新兴风味趋势的信息，以作为今年及以后产品开发的灵感。市场研究公司提供的信息、对社交媒体网站上出现或社交媒体影响者提及的最新和即将出现的食品和饮料口味的观察，以及协同口味科学家和营销人员的专业知识，有助于确定北美市场10种口味和拉丁美洲市场7种口味的列表。北美的10种口味分别是柚子、糯米团、酸樱桃、姜黄、斯佩库洛斯、抹茶、山核桃、羊肚菌、曲奇面团和生日蛋糕。报告中提到的7种拉丁美洲风味分别是芋头、火龙果、提拉米苏、巴西莓、阿尔法约雷斯、特雷斯莱奇和木瓜奶油。 风味趋势信息被汇编成两个报告。除了提供对这些口味的概述之外，这些报告还对这些口味如何以及为什么在这两个市场中都能发挥作用，哪些口味具有全球潜力，哪些口味具有从运动营养到其他类别的交叉潜力。消费者对干净、简单的食品标签的需求，以及由消费者认可的原料制成的食品，促使人们使用天然原料。去年，作为合成原料的替代品，许多原料首次亮相，并将在2019年继续推广。有一个领域已经看到了大量的投资，那就是寻找天然衍生的替代合成成分，以解决食品安全和食品保存问题。常用的人工防腐剂如没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole, 简称BHA)和丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene, 简称BHT)传统上被用于保存各种食品。然而，在这个清洁标签意识的时代，制造商正试图在适当的时候用自然衍生的替代品重新制定。 最近几个月，成分开发人员已经发布了新的成分来取代合成成分。纳图瑞克斯（Naturex）提供的XtraBlend RN是迷迭香和菠菜提取物的混合物，可以对抗蛋黄酱和调味料中的脂质氧化，取代EDTA。EDTA是一种合成成分，用于防止蛋黄酱和其他脂质乳剂中的异味和颜色退化。纳图瑞克斯的研究人员研究了400多种可食用植物的提取物，研究了它们的螯合和抗氧化特性，然后确定了具有协同作用、功能与EDTA相同的提取物的混合物。他们确定迷迭香和菠菜提取物的特定混合物是最有效的。组成XtraBlend RN的专利混合物被认为是一种螯合剂和自由基清除剂，不会影响成品的味道。几个月前，科尔比翁（Corbion）推出了一种由醋和天然香料制成的成分，以取代丙酸钙。丙酸钙是烘焙行业用来延长面包保质期的一种合成防腐剂。这种名为Verdad MP100的成分可以抑制霉菌的生长，据该公司称，它是第一个既能像丙酸钙一样抑制霉菌生长，又不会对产品味道产生负面影响的清洁标签霉菌抑制剂。为了防止某些肉制品的氧化和酸败，克明工业公司最近开发了Fortium RVC，这是一种迷迭香和抗坏血酸的混合物，有助于延缓脂质氧化的发生，并为制造商提供了一种消费者友好的成分，可替代传统生育酚。它被添加到植物油中，延长了散装油和使用这些油的产品的货架期，如面包店和零食。去年11月，该公司还分享了对其清洁标签替代品有效性的看法，包括FORTIUM RGT12 Plus Dry，一种迷迭香和绿茶提取物的混合物。FORTIUM RGT12加上干防止氧化熟冷冻猪肉香肠肉饼有效的合成选择。测试表明，该成分在整个香肠肉饼12个月的保质期内都能有效地延缓氧化。结果还表明，感官小组成员更喜欢添加了该成分的香肠的味道，而不是添加了合成成分和未经处理的样品。凯敏的其他成分组合包括bactohalt NV和NaturFORT RSGT。第一种是以醋为基础的成分，可以延长即食肉类、新鲜肉类和家禽以及鱼类产品的货架期。另一种是迷迭香、薄荷和绿茶萃取物的混合物，可以代替EDTA在沙拉酱和调味汁中的作用。新咖啡、茶味精选咖啡和茶是世界上比较受欢迎的两种饮料。咖啡和茶味产品也正成为一种趋势，因为产品开发商希望吸引那些喜欢咖啡和茶味的消费者，以及那些愿意尝试新口味的消费者。为此，德之馨（Symrise）在2018年12月发布了一系列咖啡和茶口味的配方，用于乳制品，如奶昔、酸奶、冰淇淋等。口味系列包括榛子、苦杏酒、咸焦糖、冷冲泡摩卡、芙蓉花印度茶拿铁、抹茶、巧克力、香草伯爵茶和白桃。德之馨的高级品类经理伊恩o瑟斯顿(Ian Thurston)表示:"消费者正在他们的食品中寻找这种优质体验，这意味着要在口味上突破界限。""我们的系列超越了咖啡和茶的口味，利用了咖啡馆的最爱和独特的口味，完美地结合了乳制品的嗜好。"开发咖啡和茶口味系列的部分灵感来自该公司专有的消费者洞察研究。在这项研究中，德之馨风味专家发现了一种他们称之为"保存、保存、摇动或搅拌"的口味趋势。他们说，这意味着"加工、混合和注入有时是对立的成分一起改变了风味，创造出独特的新东西。"蛋白质溶解酶曾是面向优秀运动员销售的食品和饮料的关键成分，如今，蛋白质已成为主流。零食、意大利面和谷类食品只是蛋白质成分出现的少数几种产品类别。这些成分来自动物和植物，每一种都提供特定的功能和营养价值。虽然这些成分可以让生产商在产品上宣称含有蛋白质，但它们可能会对成品的质量产生负面影响，比如口感不佳或颗粒状。 制造商在使用蛋白质成分时可能遇到的另一个挑战是溶解度。天野酶（Amano Enzymes）最近推出了蛋白谷氨酰胺酶天野500，一种蛋白谷氨酰胺酶，据说可以提高蛋白质在低pH值下的溶解度。天野酶技术服务副总裁肯（Ken Iritani）解释说:"当蛋白质被添加到低pH值的配方中时，它们会沉淀，限制了风味掩盖和配方选择。""我们希望这种酶能成为饮料公司开发果味蛋白奶昔的突破性进展，同时也能为蓬勃发展的蛋白质市场开发其他产品。"谷氨酰胺酶Amano 500将谷氨酰胺在蛋白质中转化为谷氨酸，这有助于在较低的pH值(约5)下增加溶解性。每一种动物蛋白成分都有其独特的氨基酸和其他营养成分组成，经常用于运动营养和功能性食品。IDF在2018年的拉斯维加斯展（SupplySide West show）上首次推出了一种名为水解CHiKPRO肉汤蛋白分离粉的鸡肉蛋白质成分;它承诺肌肉建设和联合支持的好处。"肌肉发育和关节健康对运动员和活跃的消费者都很重要，"IDF销售、营销和技术副总裁斯蒂芬妮·林奇(Stephanie Lynch)说。这种成分使得食品、饮料和运动营养品生产商可以用一种成分为他们的产品添加这两种诱人的好处。此外，我们的鸡肉原料是无过敏、全天然、对酮友好、经过认证的旧石器时代。"水解的CHiKPRO肉汤蛋白分离粉提供了一个完整的氨基酸剖面和II型胶原蛋白。它也是一种易于使用的成分，配方纳入到奶昔，奶昔，零食，和更多。林奇说:"这种成分是部分可溶的，可以在多种应用中对结构和纹理做出贡献。""该产品有轻微的鸡肉味道，可以增强许多零食的味道。"CHiKPRO肉汤蛋白分离粉采用100%美国农业部鸡肉原料水解而成。 虽然生产水解的CHiKPRO肉汤分离蛋白粉的具体细节是专有的，但田埂（Lynch）股份公司表示，它确实涉及氨基酸的提取。脂类、脂肪和油脂的进步在各种食品类别中都发挥着重要作用。专门研究开发脂质成分的专家继续改进这些成分的功能和营养特性。嘉吉(Cargill)和巴西尤妮安普大学(Unicamp University)使用专利技术开发了Levia +e酥油。该公司表示，这种酥油含有较少的饱和脂肪，不会影响成品的口感和质地。该成分的饱和脂肪含量可以根据应用程序从25%到35%不等，而市场上的其他解决方案的饱和脂肪含量可以从45%到65%不等。Levia +e是100%脂质，在稠度和质地上与传统脂肪具有相同的物理结构。它可以用来制作饼干、蛋糕、冰淇淋、巧克力馅等等。该公司正在测试这种成分，以便在墨西哥和委内瑞拉使用。 另一项脂肪和油脂的创新承诺给烘焙师带来方便和易用性，并为烘焙食品增添时尚风味。从AAK中缩短薄片可以改善质地和柔软度，而不需要滚入过程，使脂肪分布均匀，减少处理和加工时间。这项技术也可以被用在调味，这使得面包师很容易添加各种口味。AAK最近推出了新的口味选择，并展示了如何在雪纺休闲蛋糕产品概念中提供各种功能。多汁的橙子味薄片和奶油香草味薄片可用于干蛋糕混合。薄片的高熔点意味着它们有很大的耐热性，能够承受加工条件造成的摩擦。这种起酥油片还可以用于蛋糕、馅饼面团、饼干、披萨皮、冰片等，可以用来增强产品的各种质感和口感。下个月的配料部分将讨论谷物。预计将重塑食品行业可持续性的三大趋势--健康和福利，以及便利性--将出现在英敏特的清单上，这些趋势预计将在2019年及以后影响食品和饮料产品的配方、包装、营销等。这家市场研究公司在其2019年全球食品和饮料趋势报告(Mintel 2018)中列出了细节。以下是一些亮点： 1：常绿消费。可持续发展的定义已经扩展到全球食品和饮料趋势报告中所称的"跨越整个产品生命周期的可持续发展的循环观点"，从原料采购到包装设计、处理或重用。在世界范围内引起注意的一些具体领域是塑料的使用、减少粮食浪费和可再生农业做法； 2：历久弥新。认识到健康老龄化是消费者关注的一个问题，这为食品和饮料制造商提供了一个关键的增长机会。全球食品和饮料趋势中认为，产品开发人员可以采取的一种策略是，将健康老龄化产品瞄准任何年龄段的消费者，这些消费者希望解决他们一生中的健康问题。英敏特预计将会更多地使用一些成分，包括l-茶氨酸、B族维生素、胆碱和-3脂肪酸，这些成分声称可以增强脑力、注意力和整体健康，以及生姜、姜黄、绿茶提取物和药用蘑菇，这些成分可能具有抗炎症作用； 3：提高便利。我们随需应变的生活方式影响了许多行业，包括食品和饮料。因此，方便食品和饮料正在发生变化，这将给我们带来更高档和优质的方便食品产品，新型的套餐，定位为除了晚餐时间以外的其他时间，以及通过自动化便利店购买食品的更快方式。人工智能甚至可能发挥作用;23%的美国消费者说他们会相信人工智能规划餐或购买食品杂货，2019全球食品和饮料趋势报告帕克产品特性的特色冰淇淋口味列表不仅是冰淇淋和冷冻甜点产品的灵感来源，也适用于烘焙、糖果、饮料和乳制品。 以下是该公司开发的12个概念，其特色是其新的烘焙内含物系列，以及其他一些内含物，如杂色、糖屑和糖果片--所有这些都赋予产品创造性的视觉吸引力、爆发力和质感增强。 1: 雪呀，真高兴遇见你！椰子冰淇淋，白巧克力奶油斑叶，白蛋糕，果仁椰子； 2: 如此简单。红糖冰淇淋，香蕉朗姆酒杂色，香草饼干，果仁胡桃； 3：帕克的金罐。奶油焦糖冰淇淋，奶油蛋糕，太妃糖； 4：巴布，被甩了真酷！蛋糕糊冰淇淋，大黄杂色，黄色蛋糕片，鲜奶油末； 5：你让我脸红了，玫瑰。玫瑰冰淇淋，爆米花，杂色糖霜，还有酥饼； 6：不要只是傻笑，傻笑不止！甜奶油冰淇淋，小甜饼干，棉花糖杂色，烤肉桂末； 7：圣诞老人飞走了。棉花糖冰淇淋，巧克力饼干杂色，红白薄荷糖； 8：在学校保持凉爽。棉花糖冰淇淋夹在两块糖饼干中间，卷在棉花糖屑里； 9：对国家集市的热爱。太妃糖冰淇淋、焦糖杂色煎蛋、布朗尼及朱古力脆饼乾片、培根糖果片； 10：怪物们混在了一起。巧克力冰淇淋，亮紫色的斑叶，巧克力蛋糕和饼干； 11：南瓜派，你怎么飞得这么高？南瓜冰淇淋，五香糕点奶油杂色，南瓜香料玉米片串，和馅饼皮片； 12：在奶奶家过圣诞节。奶油山核桃冰淇淋，热巧克力杂色，馅饼皮，奶油果仁山核桃。 英诺华市场洞察力（Innova Market Insights）追踪全球食品和饮料产品的发布活动。根据英诺华市场洞察2019年十大趋势，这里的趋势最有可能影响产品开发（Innova 2018）。 1）发现：冒险的消费者。消费者正在走出他们的舒适区，寻找新的食物体验、更大胆的口味和多感官的食物体验； 2）植物王国。随着品牌为吸引主流消费者而修改其产品组合，以工厂为基础的市场继续增长； 3）所有的选择。随着越来越多的消费者关注健康和可持续性，英诺华市场洞察所称的替代食品和配料的使用有所增加。这可能意味着小麦、奶制品和动物蛋白质等有了更多的替代品； 4）绿色呼吁。越来越多的制造商正在制定解决食品浪费和可持续包装等问题的举措； 5）吃零食：决定性的时刻。消费者正在寻找零食，什么被认为是零食不同于过去。在日常生活中，偷吃已经成为一种机会而不是一种选择。此外，还强调健康的零食和零食形式的创新； 6）为我吃饭。科技的进步和食品服务和零售产品的选择越来越多，给消费者提供了更多的个人饮食方式的机会。这意味着可以进行定制、个性化和满足个人饮食需求的食品产品和服务； 7）重新审视纤维。纤维因其消化功能而备受赞誉，目前正因其新发现的功效而得到推广。市场研究计划了光纤需求的增长和新的光纤应用； 8）我感觉很好。营养可以在情感和心理健康中发挥重要作用。英诺华市场洞察力正在跟踪那些让"感觉良好"的产品，这些产品声称或承诺支持大脑。情感和心理健康领域的一个最新趋势是对CBD注入产品的兴趣； 9）小玩家心态。初创公司将继续影响食品和饮料行业。Innova Market Insights发现，初创企业正成功地与大型食品公司展开竞争，而大型食品公司的战略规模也在不断缩小； 10）连接到餐盘上。数字技术的进步使人们有了更大的透明度和信息，让消费者有机会更接近他们的食物。 智能标签和区块链技术是实现这一点的众多工具中的两个。技术也为消费者提供了更多的参与机会。专注于真正的天然香料德之馨于2018年10月推出了其"天然口味解决方案准则"平台，该平台是公司香料部门的总体定位，旨在满足消费者对低加工食品和饮料的需求，这些食品和饮料具有真正的口味。该公司承诺，通过优化其口味和加工方式，使其对营养的影响最小，为该项目开发天然衍生成分。德之馨还计划在开发原料时整合可持续的采购方法。"消费者想要终极的味觉体验，"德之馨营销和消费者洞察副总裁兼全球营销领导者伊曼纽尔·拉罗克（Emmanuel Laroche）说。他们希望真正的食品是用经过精心采购和准备的最好的天然原料制成的。"赛姆瑞斯将利用其戴安娜食品集团（Diana Food Group）的食品原料专家的专业知识，为食品和饮料制造商开发天然来源的原材料解决方案，以帮助满足消费者对植物为基础的营养解决方案。为天然口味解决方案准则开发的配料将分为七类：香草、食品基料、鸡肉、洋葱、柑橘、植物和水果。
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