《SARS-CoV-2和其他谱系B beta冠状病毒的细胞进入和受体使用的功能评估》

  • 来源专题:新发突发疾病(新型冠状病毒肺炎)
  • 编译者: 蒋君
  • 发布时间:2020-03-13
  • 在过去的20年中,几种冠状病毒已经越过了物种壁垒进入人类,引起了严重的,常常是致命的呼吸道疾病的爆发。自从SARS-CoV在动物市场首次被发现以来,全球病毒学项目已经在不同的动物和地理区域中发现了数千种冠状病毒序列。不幸的是,几乎没有可用的工具来对这些病毒进行感染人类的??功能进行功能测试,这严重地阻碍了预测下一次人畜共患病毒爆发的努力。在这里,我们开发了一种方法来快速筛选沿袭的B型β冠状病毒,例如SARS-CoV和最近的SARS-CoV-2,以了解受体的使用及其感染不同物种细胞类型的能力。我们表明,病毒进入过程中的宿主蛋白酶加工是几种谱系B病毒的重要屏障,绕过该屏障可使几种谱系B病毒通过未知受体进入人类细胞。我们还证明了不同的B谱系病毒如何重组以进入人体细胞,并证实人ACE2是最近出现的SARS-CoV-2的受体。

  • 原文来源:;https://www.nature.com/articles/s41564-020-0688-y
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    • 编译者:hujm
    • 发布时间:2020-02-29
    • 2月24日,《Nature Microbiology》发表了美国国家过敏与传染病研究所的题为“Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses”的文章。 自SARS-CoV-2首次在动物市场内被发现以来,全球病毒组学研究组已经在不同动物和地理区域内发现了数千个冠状病毒序列。但几乎没有可用的工具来测试这些病毒感染人类的能力,这严重阻碍了预测下一次人畜共患病病毒爆发的实现。文章作者开发了一种快速筛选B系β-冠状病毒的方法,用于病毒受体利用及其感染不同物种细胞的能力。研究发现,宿主蛋白酶处理是几种B系冠状病毒进入细胞过程的一个重要屏障,绕过这一屏障可使几种B系冠状病毒通过未知受体进入人类细胞。文章还分析了不同的B系冠状病毒是如何重组进入人类细胞的,并证实人类ACE2蛋白是最近发现的SARS-CoV-2的受体。
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    • 来源专题:实验室生物安全
    • 编译者:张虎
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    • 1.测定COVID-19恢复期患者的免疫学表型 对COVID-19恢复期成年患者和2015-2018年收集的非暴露人群外周血单核细胞(PBMCs)和血清样本进行侧向层析、SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域(RBD) ELISA、流式细胞检测。结果显示所有患者IgG阳性,绝大多数患者IgM、IgA阳性;CD3+细胞轻度增加;CD19+细胞轻度减少,CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD3-CD19-细胞或CD14+CD16-单核细胞与非暴露组无明显差异。同时非暴露组HCoV-OC43和HCoV-NL63RBD呈现不同程度的IgG阳性。 2.构建SARS-CoV-2表位库 根据预测的SARS-CoV-2抗原表位,作者构建了不同的表位库(megapool,MP)——排除了刺突蛋白抗原、能够捕获50%总反应、用于预测主要HLA-ⅡCD4+ T细胞表位的CD4_R MP;覆盖整个刺突蛋白抗原的MP_S;针对12个主要HLA-Ⅰ等位基因(ⅠA、ⅠB)的CD8 MP_A和CD8 MP_B。 3.分析特异性T细胞应答反应 使用CD4_R MP或MP_S刺激PMBCs,通过流式检测TCR依赖的激活诱导标志物(AIM)定性或定量分析CD4+ T细胞应答反应。结果显示所有患者CD4+T细胞对SARS-CoV-2刺突蛋白和非刺突蛋白均存在明显的异性反应,且平均约有50%的反应针对刺突蛋白表位;有趣的是,非暴露组同样检测到刺突蛋白和非刺突蛋白特异性CD4+T细胞,说明存在交叉免疫反应。为进一步评估SARS-CoV-2 特异性CD4+T细胞的功能和分化情况,作者检测了MP刺激后的细胞因子水平,发现IL-2 、IFN-γ分泌增加,几乎没有IL-4、IL-5、IL-13或IL-17α表达,说明特异性CD4+T细胞是有功能的,且以TH1型为主。 类似地,使用CD8 MP_A、CD8 MP_B刺激PBMCs,通过检测AIM和细胞内细胞因子染色(ICS)分析CD8+T应答反应。结果显示70%患者CD69+CD137+阳性,ICS检测到IFNγ+CD8+T细胞,且大多数共表达颗粒酶B,少部分表达TNF,而不表达IL-10,说明COVID-19患者存在SARS-CoV-2特异性CD8+T细胞反应。 由于刺突蛋白是SARS中和抗体的主要靶标,且抗体依赖于CD4+T细胞的辅助发挥保护作用,于是作分析了CD4+T细胞与抗体之间的相关性。结果显示抗刺突蛋白RBD Ig和IgG与CD4+T细胞、CD4+T细胞与CD8+T细胞高度相关。 4.CD4+和CD8+T细胞SARS-CoV-2 ORF靶点的研究 作者设计了代表单一抗原的表位库用以进一步探究CD4+T细胞和CD8+T细胞靶向抗原。结果显示引起COVID-19患者特异性CD4+T细胞反应的主要有刺突蛋白(27%)、M蛋白(21%)和N蛋白(11%),nsp3, nsp4 and ORF8引起部分反应(大约各占5%);在非暴露组,主要由刺突蛋白(23%)、nsp14 (25%)、nsp4 (15%) 和 nsp6 (14%)引起CD4+T反应。与CD4+T细胞反应不同,引起COVID-19患者CD8+T细胞反应的有刺突蛋白(~26%)、N(~12%)、M(22%)、NSP6(15%)、ORF8(10%)和ORF3a(7%);未暴露组未显示明显的靶向抗原,提示冠状病毒CD8+T细胞交叉反应存在,但不如CD4+T细胞交叉反应广泛。